04细菌病毒培养技术
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接前要经过健康观察，以免误用带有病原体动物。
➢动物接种途径和方法
1.皮内接种 2.皮下接种 3.肌肉接种 4.静脉接种 5.腹腔接种
➢ 动物接种后的饲养管理与收获病毒
1.接种病毒后的动物,每天观察和检查规定的
各项指标，主要有精神、食欲、粪便、尿液、被毛
状态、活动情况和接种部位的局部反应，每天测体
三 细菌的计数技术
细菌性疫苗在制造中，往往需要计算每毫升所含细 菌的总数。 1.显微镜直接计数法 2.活菌计数法 ➢倾注平板培养法 将被测样品根据菌数含量多少， 用普通肉汤或生理盐水作10倍递进稀释。分别取其 1ml加在灭菌的平皿中，然后取预先加热融化且冷至 45～50℃，立即摇匀放平，凝固后培养，统计平皿上 长出的菌落数，乘以稀释倍数，即为每毫升样品中含 有的活菌数。
➢ 微量点板计数法 接种量为0.02ml
3 比浊计数法
是对比细菌悬液与标准管的浊度，求出大致的 菌数。
原理：菌液中含数多少与其浑浊度成正比。
方法：比浊管比浊法和分光光度计法。
优点：快速简便
应用：常用于菌苗及其他生物制剂的生产、细 菌毒力的测定和攻毒量的确定等。
标准比浊法
比浊管 由国家生物制品检定部门提供，每套包括一 支细菌比浊标准管、数支对照空管和一张比浊用的图 片。
分光光度计法
借助于分光光度计。在一定波长下测定菌液的 光密度值
注意 ：测量时一定要控制菌浓度与光密度成 正比的线性范围内，否则不准确。
病毒培养技术
1 病毒的复制 2 病毒的动物培养技术 3 病毒的禽胚培养技术 4 病毒的细胞培养技术
病毒复制：以病毒基因为模板，在酶的作用下，分别合成基因和蛋 白质，再组装成完整的蛋白颗粒，这种方式称为复制（ replication) 。
➢ 平板表面散布法 接种量为0.1ml
➢ 琼脂板的制备 计数
稀释菌液
接种
培养
➢ 选择菌落数在30～300之间的平皿用以计数，每个稀释度应取
-8
其菌落平均数。
活菌数／ml=2个平板平-均8 菌落数×10 10×稀释倍数。
举例：在10 稀释的平板中所得平均菌落数为78个。
计算结果：78×10×10 =7.8×10 个活菌／ml
吸附 侵入
病毒大分 子合成
装配 释放
早期：病毒特异性酶的合成 病毒核酸复制 病毒结构蛋白质合成
病毒培养技术
1 病毒的复制 2 病毒的动物培养技术 3 病毒的禽胚培养技术 4 病毒的细胞培养技术
1 病毒的动物培养技术
➢ 动物的选择
应当选择SPF动物。选择动物的条件下： ✓ ①选用对病毒易感性高。 ✓ ②动物健康、体重、年龄尽可能一致，符合培养病毒要求。 ✓ ③遗传特性相似，实验结果具有一致性、准确性和可比性。 ✓ ④外购动物要了解当地动物群健康，饲养及免疫接种情况，
分散细胞的方法
各种组织是靠细胞间质黏合而成的，要获得分散的细胞， 必须破坏细胞间质。分散细胞的方法的三种：
机械分散法：适用于细胞间连接较松的组织，如禽胚 组织。
酶消化法：此法适用于原代细胞的制备及细胞的传代 培养。
螯合剂分散法：一般只用于单层细胞的分散。
细胞培养方法
1.单层细胞培养法 用胰酶将剪碎的组织或传代细胞分散成2～6个成
细胞培养的基本条件
1.培养液：生长液、维持液，Eagle氏液、RPMI-1640、 199、DMEM、MEM等营养液 。
2.细胞接种量:适宜。 3.pH：一般为7.0～7.4因细胞种类不同而略有差异。 4.温度：一般为37～38℃。 5.气体：氧气和二氧化碳。 6.无菌条件：培养的全过程都要求严格的无菌条件 。
透析器
1.螺栓 2.培养基贮存室 3.视镜 4.透析膜 5.培养室
5、连续培养
连续培养 系统是一个恒 定体积的流动 系统，新鲜培 养基以恒定的 速度流入，又 以相同的速率 流出除去多余 的液体，细菌 始终保持在对 数生长期。
细菌培养技术
1 细菌的培养基本知识 2 细菌的规模化培养 3 细菌的计数技术
正粘病毒和副粘病 毒，10～11日龄
鹦鹉热衣原体和立克 次氏体等，6～8日龄
流感、新城疫、传 支等，9～11日龄
操作要点
4 禽胚的接种后孵育
接种后，蜡泪封孔，置37℃下孵化 ， 每天照蛋2次以上，通过禽胚的病变初步确 定病毒的存在及增殖情况，淘汰24h内死胚。 病毒感染指征： 死亡
充血、出血或出现坏死灶 畸形 出现痘斑
团的细胞，接种到培养瓶或培养板上，让细胞贴壁 生长，静置培养或转瓶生长培养。 2.悬浮细胞培养法（搅拌培养）
通过振荡或转动装置使细胞始终分散悬浮于培养 液内的培养方法。 3.微载体培养
通过搅拌悬浮在培养液内，使微小细胞在载体表 面繁殖成单层的一种细胞培养技术，兼有单层和悬 浮细胞培养的优点。
犊牛肝脏单层细胞
二、细菌的规模化培养
➢ 种子接种 是指菌体增殖培养物。 ➢ 收获时间 最佳培养时间依据细菌的生长曲线而定。
对 数 生 长 期
➢培养方法
1．固体培养基表面培养法
用于制备抗原、灭活苗、冻干苗。
2．液体静置培养法
需氧菌（深度1/2）和兼性厌氧均可用，厌氧菌（深度 3/4），还需加肝块。
3．深层通气培养法
病毒培养技术
➢ 细胞的选择
选择相应易感动物的组织细胞。
➢ 细胞培养病毒条件
⒈血清：促进细胞生长和贴壁的成分。 ⒉温度：多数为37℃ 。 ⒊pH 值：pH在7.6～7.8 ⒋接毒量与接毒方法：一般按维持液的1～10%接入 。
➢病毒增值指标与收获
多数病毒在敏感细胞增殖可引起细胞代谢等方面的变 化，发生形态改变，即细胞病变（CPE）。通常用 CPE作为判定病毒毒力的指标，即计算病毒的TCID50。 CPE显微镜下主要表现为： ①细胞圆缩 ②细胞融合形成合胞体 ③轻微病变
有些病毒在细胞上增殖并不产生CPE，可检查包涵 体和血凝性作为病毒增殖的指标。
检测病毒
正常细胞
病变细胞
谢谢！
操作要点
5 病毒的收获
羊膜腔接种 尿囊膜接种 绒毛尿囊膜接种 卵黄囊接种
照蛋
尿囊腔接种法
接种部位消毒
尿囊腔接种
收获尿囊液—每枚鸡胚收获尿囊液6～8ml
病毒培养技术
1 病毒的复制 2 病毒的动物培养技术 3 病毒的禽胚培养技术 4 病毒的细胞培养技术
细胞培养技术（cell culture)
温1次，做好记录。
2.出现反应症候动物，按规定方法剖杀，采取 含病毒高的组织脏器。
病毒培养技术
1 病毒的复制 2 病毒的动物培养技术 3 病毒的禽胚培养技术 4 病毒的细胞培养技术
2 病毒的禽胚培养技术
工序过程：
如何完成此 项任务？
选择禽胚 前孵育 接种
后孵育
收获病毒
操作要点
得单个细胞，如鸡胚成纤维细胞，此细胞对病毒的检测最为敏感， 但制备和应用不方便。 ⑵二倍体细胞（细胞株） 由原代细胞或次代细胞选育出具有特殊 生物学性质和标记的细胞，如猪肾细胞株（PK-15）和乳仓鼠肾细 胞株（BHK-21）等。适用于病毒性生物制品的制备，常用于疫苗 生产，安全可靠。 ⑶传代细胞（非二倍体细胞系、异倍体细胞） 指不再保持原来细 胞的二倍体细胞数，在体外可以无限传代的细胞，如人子宫癌细 胞（HeLa细胞）和鼠肾腺癌细胞（RAG细胞）等。有致癌性，不 能用于疫苗生产，多用于病毒的分离鉴定。
是目前菌苗生产的主要培养法。安装有自动控温、消泡、 调pH、自动控制通气量、自动磁力搅拌等装置。细菌接 种1～2h，再通入滤过除菌空气，并适当搅拌分散通入 的气体，以增加培养液中的溶氧量。及时补充营养 。
4．透析培养法
在细菌培养液与培养基之间隔有一层透析 膜，使培养基中高浓度小分子量的营养成 分通过透析膜（不能透过大分子的细菌或 毒素）不断扩散到细菌培养液中，供细菌 生长繁殖，获得高浓度的细菌或毒素。
细菌培养技术
1 细菌的培养基本知识 2 细菌的规模化培养 3 细菌的计数技术
（一） 细菌生长繁殖的条件
①水
②碳源
1、营养物质 2、温度
③氮源 ④无机盐 ⑤生长因子 有些细菌需要
3、渗透压 4、PH
4、对气体要求
①对氧气要求：专性需氧菌 微需氧菌 兼性厌氧菌 专性厌氧菌
②对CO2要求： 5% CO2
器官开始的培养。 次代培养：将原代细胞培养物轻微消化后，
再洗下分装至含新鲜培养液的培养管中继续培 养。 传代培养：将培养细胞以一个培养瓶转移或 移植到另一个培养瓶中进行培养。
培养常用的细胞
上皮细胞、成纤维细胞 根据培养细胞的染色体和繁殖特性，可分为： ⑴原代细胞 直接利用新鲜动物组织经胰蛋白酶消化、分散，获
比浊方法 将空管拭刷干净，加入待测菌液1ml。将 标准管与待测管并列紧贴在图片前，使两管受光均匀， 然后透过两管管壁对比观察，目测图片的清晰度，并 将两管左右换位，反复对比。
例如：测定大肠杆菌的菌数，若1ml菌液加入4ml的生 理盐水后，与标准管的浊度相同，即表示该菌液经5 倍稀释后相当于标准管。大肠杆菌标准管的菌数相当 于8亿个／ml，故被测菌数为8×5=40亿个／ml。
➢ 1 禽胚的选择
理想的禽胚是SPF鸡胚，常以非免疫鸡胚补充。
2 禽胚的接种前孵育
孵化前消毒，温度37.5～38.5℃，相对湿度50%～60%， 定时翻蛋，保证通风。孵化4～5d照蛋检查，淘汰无精蛋 和死胚，孵化至所培养病毒需要的日龄即可接种。
3 禽胚的接种途径
痘病毒和疱疹病 毒，10～13日龄
细胞培养技术是选用各种细胞的最佳生存条 件对活细胞进行培养和研究的技术。
即：利用机械、酶或化学方法使活体动物组 织或传代细胞分散成单个乃至2～4个细胞团 悬液的培养，使之能继续生存、生长、增殖 的一种方法。
广义上:还包括组织培养、器官培养。
3 病源自文库的细胞培养技术
细胞培养的方式 原代培养：从直接取自生物体细胞、组织或
（二）细菌生长繁殖的方式 链球菌
繁殖方式： 二分裂法
八 叠 球 菌 葡萄球菌
（三）细菌生长繁殖的速度
（四）细菌生长繁殖的速度
分为四期：迟缓期 、 对数期、稳定期、衰退期
（五）常用培养基种类
厌氧培养基
选择培养基
增菌培养基
鉴别培养基
基础培养基
细菌培养技术
1 细菌的培养基本知识 2 细菌的规模化培养 3 细菌的计数技术
➢动物接种途径和方法
1.皮内接种 2.皮下接种 3.肌肉接种 4.静脉接种 5.腹腔接种
➢ 动物接种后的饲养管理与收获病毒
1.接种病毒后的动物,每天观察和检查规定的
各项指标，主要有精神、食欲、粪便、尿液、被毛
状态、活动情况和接种部位的局部反应，每天测体
三 细菌的计数技术
细菌性疫苗在制造中，往往需要计算每毫升所含细 菌的总数。 1.显微镜直接计数法 2.活菌计数法 ➢倾注平板培养法 将被测样品根据菌数含量多少， 用普通肉汤或生理盐水作10倍递进稀释。分别取其 1ml加在灭菌的平皿中，然后取预先加热融化且冷至 45～50℃，立即摇匀放平，凝固后培养，统计平皿上 长出的菌落数，乘以稀释倍数，即为每毫升样品中含 有的活菌数。
➢ 微量点板计数法 接种量为0.02ml
3 比浊计数法
是对比细菌悬液与标准管的浊度，求出大致的 菌数。
原理：菌液中含数多少与其浑浊度成正比。
方法：比浊管比浊法和分光光度计法。
优点：快速简便
应用：常用于菌苗及其他生物制剂的生产、细 菌毒力的测定和攻毒量的确定等。
标准比浊法
比浊管 由国家生物制品检定部门提供，每套包括一 支细菌比浊标准管、数支对照空管和一张比浊用的图 片。
分光光度计法
借助于分光光度计。在一定波长下测定菌液的 光密度值
注意 ：测量时一定要控制菌浓度与光密度成 正比的线性范围内，否则不准确。
病毒培养技术
1 病毒的复制 2 病毒的动物培养技术 3 病毒的禽胚培养技术 4 病毒的细胞培养技术
病毒复制：以病毒基因为模板，在酶的作用下，分别合成基因和蛋 白质，再组装成完整的蛋白颗粒，这种方式称为复制（ replication) 。
➢ 平板表面散布法 接种量为0.1ml
➢ 琼脂板的制备 计数
稀释菌液
接种
培养
➢ 选择菌落数在30～300之间的平皿用以计数，每个稀释度应取
-8
其菌落平均数。
活菌数／ml=2个平板平-均8 菌落数×10 10×稀释倍数。
举例：在10 稀释的平板中所得平均菌落数为78个。
计算结果：78×10×10 =7.8×10 个活菌／ml
吸附 侵入
病毒大分 子合成
装配 释放
早期：病毒特异性酶的合成 病毒核酸复制 病毒结构蛋白质合成
病毒培养技术
1 病毒的复制 2 病毒的动物培养技术 3 病毒的禽胚培养技术 4 病毒的细胞培养技术
1 病毒的动物培养技术
➢ 动物的选择
应当选择SPF动物。选择动物的条件下： ✓ ①选用对病毒易感性高。 ✓ ②动物健康、体重、年龄尽可能一致，符合培养病毒要求。 ✓ ③遗传特性相似，实验结果具有一致性、准确性和可比性。 ✓ ④外购动物要了解当地动物群健康，饲养及免疫接种情况，
分散细胞的方法
各种组织是靠细胞间质黏合而成的，要获得分散的细胞， 必须破坏细胞间质。分散细胞的方法的三种：
机械分散法：适用于细胞间连接较松的组织，如禽胚 组织。
酶消化法：此法适用于原代细胞的制备及细胞的传代 培养。
螯合剂分散法：一般只用于单层细胞的分散。
细胞培养方法
1.单层细胞培养法 用胰酶将剪碎的组织或传代细胞分散成2～6个成
细胞培养的基本条件
1.培养液：生长液、维持液，Eagle氏液、RPMI-1640、 199、DMEM、MEM等营养液 。
2.细胞接种量:适宜。 3.pH：一般为7.0～7.4因细胞种类不同而略有差异。 4.温度：一般为37～38℃。 5.气体：氧气和二氧化碳。 6.无菌条件：培养的全过程都要求严格的无菌条件 。
透析器
1.螺栓 2.培养基贮存室 3.视镜 4.透析膜 5.培养室
5、连续培养
连续培养 系统是一个恒 定体积的流动 系统，新鲜培 养基以恒定的 速度流入，又 以相同的速率 流出除去多余 的液体，细菌 始终保持在对 数生长期。
细菌培养技术
1 细菌的培养基本知识 2 细菌的规模化培养 3 细菌的计数技术
正粘病毒和副粘病 毒，10～11日龄
鹦鹉热衣原体和立克 次氏体等，6～8日龄
流感、新城疫、传 支等，9～11日龄
操作要点
4 禽胚的接种后孵育
接种后，蜡泪封孔，置37℃下孵化 ， 每天照蛋2次以上，通过禽胚的病变初步确 定病毒的存在及增殖情况，淘汰24h内死胚。 病毒感染指征： 死亡
充血、出血或出现坏死灶 畸形 出现痘斑
团的细胞，接种到培养瓶或培养板上，让细胞贴壁 生长，静置培养或转瓶生长培养。 2.悬浮细胞培养法（搅拌培养）
通过振荡或转动装置使细胞始终分散悬浮于培养 液内的培养方法。 3.微载体培养
通过搅拌悬浮在培养液内，使微小细胞在载体表 面繁殖成单层的一种细胞培养技术，兼有单层和悬 浮细胞培养的优点。
犊牛肝脏单层细胞
二、细菌的规模化培养
➢ 种子接种 是指菌体增殖培养物。 ➢ 收获时间 最佳培养时间依据细菌的生长曲线而定。
对 数 生 长 期
➢培养方法
1．固体培养基表面培养法
用于制备抗原、灭活苗、冻干苗。
2．液体静置培养法
需氧菌（深度1/2）和兼性厌氧均可用，厌氧菌（深度 3/4），还需加肝块。
3．深层通气培养法
病毒培养技术
➢ 细胞的选择
选择相应易感动物的组织细胞。
➢ 细胞培养病毒条件
⒈血清：促进细胞生长和贴壁的成分。 ⒉温度：多数为37℃ 。 ⒊pH 值：pH在7.6～7.8 ⒋接毒量与接毒方法：一般按维持液的1～10%接入 。
➢病毒增值指标与收获
多数病毒在敏感细胞增殖可引起细胞代谢等方面的变 化，发生形态改变，即细胞病变（CPE）。通常用 CPE作为判定病毒毒力的指标，即计算病毒的TCID50。 CPE显微镜下主要表现为： ①细胞圆缩 ②细胞融合形成合胞体 ③轻微病变
有些病毒在细胞上增殖并不产生CPE，可检查包涵 体和血凝性作为病毒增殖的指标。
检测病毒
正常细胞
病变细胞
谢谢！
操作要点
5 病毒的收获
羊膜腔接种 尿囊膜接种 绒毛尿囊膜接种 卵黄囊接种
照蛋
尿囊腔接种法
接种部位消毒
尿囊腔接种
收获尿囊液—每枚鸡胚收获尿囊液6～8ml
病毒培养技术
1 病毒的复制 2 病毒的动物培养技术 3 病毒的禽胚培养技术 4 病毒的细胞培养技术
细胞培养技术（cell culture)
温1次，做好记录。
2.出现反应症候动物，按规定方法剖杀，采取 含病毒高的组织脏器。
病毒培养技术
1 病毒的复制 2 病毒的动物培养技术 3 病毒的禽胚培养技术 4 病毒的细胞培养技术
2 病毒的禽胚培养技术
工序过程：
如何完成此 项任务？
选择禽胚 前孵育 接种
后孵育
收获病毒
操作要点
得单个细胞，如鸡胚成纤维细胞，此细胞对病毒的检测最为敏感， 但制备和应用不方便。 ⑵二倍体细胞（细胞株） 由原代细胞或次代细胞选育出具有特殊 生物学性质和标记的细胞，如猪肾细胞株（PK-15）和乳仓鼠肾细 胞株（BHK-21）等。适用于病毒性生物制品的制备，常用于疫苗 生产，安全可靠。 ⑶传代细胞（非二倍体细胞系、异倍体细胞） 指不再保持原来细 胞的二倍体细胞数，在体外可以无限传代的细胞，如人子宫癌细 胞（HeLa细胞）和鼠肾腺癌细胞（RAG细胞）等。有致癌性，不 能用于疫苗生产，多用于病毒的分离鉴定。
是目前菌苗生产的主要培养法。安装有自动控温、消泡、 调pH、自动控制通气量、自动磁力搅拌等装置。细菌接 种1～2h，再通入滤过除菌空气，并适当搅拌分散通入 的气体，以增加培养液中的溶氧量。及时补充营养 。
4．透析培养法
在细菌培养液与培养基之间隔有一层透析 膜，使培养基中高浓度小分子量的营养成 分通过透析膜（不能透过大分子的细菌或 毒素）不断扩散到细菌培养液中，供细菌 生长繁殖，获得高浓度的细菌或毒素。
细菌培养技术
1 细菌的培养基本知识 2 细菌的规模化培养 3 细菌的计数技术
（一） 细菌生长繁殖的条件
①水
②碳源
1、营养物质 2、温度
③氮源 ④无机盐 ⑤生长因子 有些细菌需要
3、渗透压 4、PH
4、对气体要求
①对氧气要求：专性需氧菌 微需氧菌 兼性厌氧菌 专性厌氧菌
②对CO2要求： 5% CO2
器官开始的培养。 次代培养：将原代细胞培养物轻微消化后，
再洗下分装至含新鲜培养液的培养管中继续培 养。 传代培养：将培养细胞以一个培养瓶转移或 移植到另一个培养瓶中进行培养。
培养常用的细胞
上皮细胞、成纤维细胞 根据培养细胞的染色体和繁殖特性，可分为： ⑴原代细胞 直接利用新鲜动物组织经胰蛋白酶消化、分散，获
比浊方法 将空管拭刷干净，加入待测菌液1ml。将 标准管与待测管并列紧贴在图片前，使两管受光均匀， 然后透过两管管壁对比观察，目测图片的清晰度，并 将两管左右换位，反复对比。
例如：测定大肠杆菌的菌数，若1ml菌液加入4ml的生 理盐水后，与标准管的浊度相同，即表示该菌液经5 倍稀释后相当于标准管。大肠杆菌标准管的菌数相当 于8亿个／ml，故被测菌数为8×5=40亿个／ml。
➢ 1 禽胚的选择
理想的禽胚是SPF鸡胚，常以非免疫鸡胚补充。
2 禽胚的接种前孵育
孵化前消毒，温度37.5～38.5℃，相对湿度50%～60%， 定时翻蛋，保证通风。孵化4～5d照蛋检查，淘汰无精蛋 和死胚，孵化至所培养病毒需要的日龄即可接种。
3 禽胚的接种途径
痘病毒和疱疹病 毒，10～13日龄
细胞培养技术是选用各种细胞的最佳生存条 件对活细胞进行培养和研究的技术。
即：利用机械、酶或化学方法使活体动物组 织或传代细胞分散成单个乃至2～4个细胞团 悬液的培养，使之能继续生存、生长、增殖 的一种方法。
广义上:还包括组织培养、器官培养。
3 病源自文库的细胞培养技术
细胞培养的方式 原代培养：从直接取自生物体细胞、组织或
（二）细菌生长繁殖的方式 链球菌
繁殖方式： 二分裂法
八 叠 球 菌 葡萄球菌
（三）细菌生长繁殖的速度
（四）细菌生长繁殖的速度
分为四期：迟缓期 、 对数期、稳定期、衰退期
（五）常用培养基种类
厌氧培养基
选择培养基
增菌培养基
鉴别培养基
基础培养基
细菌培养技术
1 细菌的培养基本知识 2 细菌的规模化培养 3 细菌的计数技术