凝胶过滤层析法教学专用

2200200年3月52070日0星-8期0五0000 1000-200000
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30-40
72 511
Sephadex的型号及性能
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3、主要用途：孔径较小的凝胶主要用于 脱盐、肽与其他小分子的分离；孔径较大 的凝胶用于蛋白质与其他大分子的分离。 DNA级的Sephadex适用于DNA或低聚核 苷酸的分离。 4、衍生系：在经典葡聚糖凝胶的基础上， 引入特殊基团后生成葡聚糖凝胶的衍生系， 主要有LH系，如以G25为母体引入羟丙基 成LH20，以G50为母体引入羟丙基成为 LH60。特点是LH系除具有凝胶过滤的作用 外，同时具有分配层析及吸附层析的作用。
排阻极性与原母体凝胶相同。LH20对芳
香多环化合物的分离比LH60好而LH60更
适用于分配层析。 ④对样品的负载量大，
负载量可高达300mg/ml凝胶。
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(二)、琼脂糖系 由经过纯化的琼脂糖制
备，其中含有极小的带电基团。利用琼
脂糖热溶液冷却时可凝胶化的特点，能
方便地制成珠状物。在凝胶过程中由单
2.5
4-6
31
50 1500-30000
500-10000
5.0
9-11
31
75 3000-70000 1000-50000
7.5
12-15 24 3
100 4000-150000 1000-100000
10
15-20 72 5
150 5000-400000 1000-150000
15
20-30 72 5
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主要的凝胶过滤 介质 (一)、葡聚糖系 1、葡聚糖系—Sephadex
结构：以氯代环氧丙烷为交联剂的葡聚糖 珠状凝胶，依据孔径不同形成G型凝胶系 列产品，G后数字表示凝胶的吸水量，是 其吸水量的10倍。G也表示凝胶交联度的 大小，G越小，交联度越大，孔径越小， 排阻的分子越小。
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2、性能： (1)溶胀性 Sephadex系均以干态供应，使 用前必须在过量的溶剂中充分溶胀后才能 使用。 (2)化学稳定性 Sephadex不溶于一切溶剂， 在水、盐溶液、有机溶剂、碱及弱酸溶剂 中均较稳定。因葡聚糖中的糖苷键在强酸 中可发生降解作用，所以只能接触强酸的 稀溶液，在0.1mol/L盐酸中可接触1～2小 时，在0.02mol/L盐酸中经6个月均无明显 变化，但要避免作用氧化剂。
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(3)物理稳定性 pH中性湿态珠体可经受 120℃、30min高压灭菌而不影响色谱性能 (4)机械强度 Sephadex凝胶的机械强度 取决于交联度，交联度越大，机械强度越 高。机械强度与柱床所能承受的压力有关， 其压力与流速的关系为：
K×ΔP V=
L
V：线速度， cm/h； ΔP：压力降，cm水柱；L：床高；K：比渗透率，受 粒径影响较大。
用寿命
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常见的凝胶种类 1、多糖类骨架的介质：以天然多糖为母体 的凝胶过滤介质，这类介质具有亲水性及与 生物大分子的相容性，可允许生物大分子透 过而不发生变性。这类介质的缺点是多为软 基质，压力降大时不易操作。因此在经典的 多糖类介质的基础上又生产出刚性、半刚性 的骨架和琼脂糖与葡聚糖接枝而成的复合凝 胶(超胶Superdex)高效介质。
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凝胶过滤介质的种类 2、合成大分子骨架的介质：选用高亲水性 单体，经共聚反应而合成的多孔结构过滤介 质。主要产品有聚丙烯酰胺类、聚乙烯醇系 及羟甲基酰胺类。 3、天然大分子与合成高聚物构成混合骨架 的介质
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主要凝胶过滤介质的牌号及骨架结构
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凝胶过滤介质应具备的条件
1、介质本身为惰性物质，在应用过程中它 不与溶质、溶剂分子发生任何作用 2、应尽量减少介质内含的带电离子基团， 以减少非特异吸附性，提高蛋白质的收率 3、介质内孔径大小要分布均匀 4、凝胶珠粒大小均匀
5、介质要具有优良的物理化学稳定性及较 高的机械强度，易于消毒，延长了介质的使
独的多糖链先形成双螺旋，然后聚集成
胶束。胶束之间有孔，孔的大小取决于
胶束的多少即琼脂糖的浓度。传统的琼
脂糖凝胶非特异性吸附极低，分离范围
很广，分离范围从10000～40000000，
所以适用于分子量差距较大的分子间分
离，分辨率不很高。琼脂糖凝胶有两种
牌号Bio－Gel A系和Sepharose
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葡聚糖凝胶(G)
型 分离范围(分子量) 吸水量 膨胀体积 浸泡时间
号 蛋白质
多糖
(克／克 (毫升／ 干凝胶) 克干凝胶) 20 90~
～ 100
25 ℃
℃
10
<700
<700
1.0
2-3
31
15
<1500
<1500
1.5
2.5-3.5
31
25 1000-5000
100-5000
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凝胶过滤层析 （分子筛层析、排阻层析）
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一、凝胶过滤介质 凝胶过滤(gel filtration)是利用凝胶的网状结 构根据被分离物质分子大小进行分离的一种 方法。 凝胶过滤的优点：
1、介质为不带电的惰性物质，不与溶质分 子作用，分离条件温和，收率高，重现性好 2、工作范围广，分离分子量的覆盖面大 3、设备简单，易于操作，周期短，可连续 使用。
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Bio－Gel A系型号及性能
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Sepharose系型号能性能
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Sepharose是该系中最早的产品， 为非交联结构，因此不能进行高压 灭菌，仅能在2～40℃范围内使用。 根据琼脂糖含量的不同，对含量为2 ％、4％及6％的产品分别命名为2B、 4B和6B。由于新型凝胶的不断出现， 此型凝胶有逐渐被淘汰的趋势。
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Sephadex经改性后比其母体具有更广泛
的用途，适用于脂类、甾类、脂肪酸、激
素、维生素及其他小分子的分级分离。
LH系列主要用途：①用于有机溶剂中的凝
胶过滤，尤其适用于嗜脂性分子及制备各
种天然产物； ②结合凝胶过滤、分配层析
及吸附层析的特点，能分离结构非常相近
的分子及其他凝胶难以处理的样品； ③