第四章 酶的分离

原则：最佳破碎效果并保持酶活性。
机械破碎法



机械捣碎法 高速旋转叶片，10000r/min。常用于动物内脏、 植物叶芽等比较脆嫩的细胞。特别是细菌。 研磨法 研钵、石磨等研磨器械，必要时可加精致石 英砂、玻璃粉、氧化铝等助磨剂。常用于微生物 和植物组织细胞的破碎。 匀浆法 硬质磨砂玻璃制成的匀浆器。常破碎易于分 散，比较柔软，颗粒细小的组织细胞。破碎程度 高，破坏力较小。
吸附剂
原理示意图：
样品
杂质
混合
吸附 作用

装柱、洗脱 注意事项： 装柱：吸附剂去杂，装柱均匀 洗脱：选择适合的洗脱剂 选择要求：洗脱剂与吸附剂不反应，不 溶解；洗脱剂对混合液各组分溶解度大， 粘度小，流动能力强，易分离；洗脱剂纯 度高。
离子交换层析

利用离子交换剂上的可解离基团（活 性基团）对各种离子的亲和力不同， 使不同物质分离的方法。


利用混合物中各组分的理化性质（分子的 大小和形状，分子极性，吸附力，分子亲 和力和分配系数等）的不同，使各组分在 两相中的分布程度不同而达到分离。 固定相，流动相。 方式：纸层析、柱层析、薄层层析 作用：吸附层析、离子交换层析、凝胶层 析、亲和层析等。
实物图
纸 层 析
展层剂 +显色 剂 培 养 皿

Fra Baidu bibliotek


常速离心机 <8000r/min，RCF：1*104g以下 细胞，细胞碎片，培养基残渣等固形物 高速离心机 10000-25000r/min ，RCF：1*104-105g。高 速冷冻离心机 沉淀，细胞碎片和细胞器 超速离心机 25000-80000r/min，RCF：5*105g 蛋白质等大分子物质
视频演示
超 声 波 细 胞 破 碎 仪
化学破碎法
利用各种化学试剂破坏细胞膜的结构， 增加膜的通透性。 有机溶剂 常用的有机溶剂有：甲苯、丙酮、丁醇 等。 表面活性剂 离子型，非离子型（特里顿、吐温）


酶学破碎法
在一定条件下，通过外加的酶或细胞自 身存在的酶作用，使细胞破碎。 外加酶处理 根据细胞壁的结构，外加适当的酶破坏 其结构，并在低渗透压的作用下使细胞破 裂。（溶菌酶） 自溶法 细胞在一定条件下，利用细胞自身存在的 酶系将细胞破碎。（蛋白酶、脂酶）
原理示意图：
+
+
+ +
-
-
-
活性基团
+
+
+
不溶性高 分子母体
+ + + + + E+
阳离子交换剂
阴离子交换剂
E+ E+
+
+
E+
E+ E+ E+
E+
E+
+ E+
+
E+
+
+ +
+
+



不溶性大分子载体：树脂、纤维素、琼脂 糖、葡聚糖等。 阳离子交换剂：活性基团是酸性基团，可 解离出H+，在一定条件下，与其他阳离子 交换。如：磺酸基，磷酸基，羧基等。 阴离子交换剂：活性基团常是碱性基团， 解离后可与OH-基结合，与其他阴离子交换。 如：伯胺，仲胺等。
薄层层析
柱 层 析
洗脱剂
样品 吸附剂
视频演示
吸附层析


利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合 液中的各组分分离的方法。 常用吸附剂：硅藻土、氧化铝、硫酸钙、活性炭 等。 可用柱层析，或直接加入 例如：枯草杆菌α-淀粉酶在弱酸性条件下，可吸 附在氧化铝上，用pH8-9的Na3PO3溶液洗脱。
0.05—0.7MPa
0.7--13MPa
常用高分子膜：丙烯腈，醋酸纤维素，硝酸纤维素，尼龙，动 物膜，羊皮纸等。

膜分离技术
借助于一定孔径的高分子薄膜，将大小、形状、
特征不同的物质颗粒或分子分离的技术。
推动力不同，可分为：
加压膜分离（超滤、反渗透）
电场膜分离（电渗析） 扩散膜分离（透析）
层析分离
常用酶沉淀分离的溶剂有乙醇，丙酮， 甲醇等。有机溶剂的含量一般为70%，用量 为酶液体积的2倍左右。

复合沉淀 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成 复合物而沉淀析出，从而使酶与杂质分离。 常用复合沉淀剂有单宁，聚乙二醇， 聚丙烯酸等高分子聚合物。

选择性变性沉淀 选择一定条件使酶溶液中存在的某些杂 质变性沉淀，而不影响所需酶，从而使酶 与杂质分离。
碱 酸
－ － － － － －－ －
带负电荷的蛋白质
脱水作用 酸
+ + + + + + + +
带正电荷的蛋白质
－ － － － － －－ －
带负电荷的蛋白质
不稳定的蛋白质颗粒


酸溶液提取 pH3－6的水溶液 用于提取在稀酸溶液 中溶解度大，且稳定性较好的酶。 胰蛋白酶 0.12mol/L的硫酸溶液。 碱溶液提取 pH8－12的水溶液 用于提取在稀碱溶液 中溶解度大，且稳定性较好的酶。 细菌 L-天冬酰胺酶 pH11－12.5的碱溶 液提取。
盐析沉淀 利用蛋白质在盐溶液中的溶解度不同特 性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐， 使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶 与杂质分离。 使用广泛，主要用于蛋白酶(P酶）的 分离纯化。 破坏分子表面的水化膜，改变胶体性 质。常用的中性盐有硫酸盐，最常见为硫 酸铵。 视频演示
蔡春尔,何培民.硫酸铵三步盐析对藻胆蛋白纯化的影响[J] 生 物技术通报, 2006 (04) ：121-125 摘要：主要研究了多次硫酸铵盐析对条斑紫菜藻胆蛋白提取 纯化效果。对分离提取的对条斑紫菜藻胆蛋白溶液进行了 3次硫酸铵溶液盐析，实验结果表明：55%饱和度可以将 绝大部分藻胆蛋白盐析；采用不同组合（15%、20%、 25%、30%、35%、40%、45%7个饱和度分别与50%、 55%、60%3个饱和度两两组合）二步硫酸铵盐析沉淀藻 胆蛋白，使R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白的盐析后纯度 （A564/A280）分别达到了1.0和0.45以上，得率分别为 1.4%和0.95%；第3次硫酸铵盐析使R-藻红蛋白、C-藻蓝 蛋白的纯度分别达到了1.4和0.4以上，最终产率分别为 1.3%和0.8%，而变藻蓝蛋白产率有所下降（从0.65%到 0.49%），但纯度变化不大。实验证明了采用多次盐析方 法可以很大程度提高藻胆蛋白纯度。


二、酶的提取


在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原 料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称 作酶的抽提。 多数酶能溶于水，可用有机溶剂、稀酸、 稀碱、稀盐等溶剂提取。提取过程中，为 了保持酶的活性，要控制好温度、pH值等 条件。
溶剂选择原则：
一般来说 极性物质易溶解于极性溶剂中，非极性物 质易溶解于非极性溶剂中； 酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易 溶于酸性溶剂中。
主要方法

盐溶液提取 0.02－0.5mol/L 用于提取在低浓度盐溶 液中溶解度较大的酶。 盐溶现象和盐析现象
蛋白质胶体溶液稳定的因素 ——水化膜、表面电荷 破坏胶体溶液的稳定条件，会使蛋白质能 够从溶液中沉淀出来。
水化膜
+ + + + + + +
带正电荷的蛋白质 脱水作用
酸 碱 在等电点的蛋白质 脱水作用 碱


离子交换剂的处理与装柱 上柱 洗脱与收集 离子交换剂的再生
凝胶层析


又称为分子筛层析，以各种多孔凝胶为固 定相，利用溶液组分中的相对分子量的不 同而进行分离的技术。 常用凝胶：葡聚糖，琼脂，琼脂糖凝胶
密度梯度混合器
储 液 室 混 合 室
搅拌器
低 到 高
注意： 1） 不同大小、形状的颗粒会形成多条条带 2） 条带的位置、宽度和离心时间有关

等密度梯度离心
当预分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的
密度梯度范围内时，在离心作用力下，不同浮力
密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，一直
移动到和它们自身浮力密度恰好相等的位置（等
类别
截留颗粒大小
截留物质
过滤介质 压力
粗滤
>2μ m
常压 酵母、霉菌、动 滤纸、滤 植物细胞、固形 布、纤维、 加压 物 多空陶瓷 减压（抽滤）
细菌、灰尘 微滤膜 0.1MPa以下
微滤 超滤 反渗 透
0.2--2 μ m 2nm—0.2 μ m <2nm
病毒、生物大分 超滤膜 子 生物小分子、盐、反渗透膜 离子

等电点沉淀 利用蛋白质两性电解质在等电点时溶解 度最低，通过调节溶液的pH值，使酶或杂 质沉淀析出，从而使酶与杂质分离。 等电点时的蛋白质分子水化膜仍在， 所以沉淀不完全，可结合盐析，有机，复 合等沉淀法同时使用，增加沉淀效果。

有机溶剂沉淀 利用酶与杂质在有机溶剂中溶解度不同， 通过添加一定量的某种有机溶剂，酶或杂 质沉淀析出，使酶与杂质分离。
第四章 酶的提取与分离纯化
酶的提取和分离纯化是指将酶从细胞或培 养基中取出，再与杂质分开，而获得与使 用目的要求相适应的有一定纯度的酶产品 的过程。 程序： 细胞破碎 酶的提取 分离纯化 浓缩与干燥 、酶的结晶

一、细胞破碎



机械破碎法 物理破碎法 化学破碎法 酶学破碎法
机械捣碎法、研磨法、匀浆法 温度差法、压力差法、超声波 有机溶剂、表面活性剂 外加酶处理法、自溶法

酶分子具有两性性质。可根据溶液pH值来 选择离子交换剂。
pH<pI 正电荷 pH=pI 两性离子 pH > pI 负电荷

选择离子交换剂的考虑因素：
离子交换剂和组分离子的理化性质；
组分离子所带电荷种类；
溶液中组分离子的浓度高低；
组分离子的质量大小； 组分离子与离子交换剂的亲和力大小。
离子交换层析主要操作步骤
Thermo Scientific 提供 FRENCH Press 细胞破碎仪和 两种规格的FRENCH Pressure 样品池。可破碎细胞、叶绿体、 血细胞、单细胞生物、动物组 织匀浆、以及其他生物粒子。 在破壁过程中不会破坏细胞的 核仁，提供均一和完全的破壁 效果。较之其他系统， FRENCH Pressure 系统提供更 大的压力，且样品不需要预处 理。
细胞匀浆器
物理破碎法

温度差法
通过温度的突然变化使细胞破碎。 骤冷 骤热 （防止酶失活）

压力差法
通过压力的突然变化使细胞破碎。 高压冲击法（50－500MPa） 突然降压法 30MPa 常压 渗透压差法（高渗溶液 低渗溶液）

超声波法
>2万Hz的声波。由于空穴作用而破碎。
French® Press Cell and Press 细胞破碎仪
密度点），形成区带。又称平衡等密度离心。
常用离心介质：铯盐，三碘苯的衍生物。
注意：


离心分离与分离物质颗粒的密度有关 条带的形状不受离心时间影响 铯盐腐蚀铝合金转子，最好使用钛合金转子
差速离心
密度梯度离心
等密度离心
过滤与膜分离



过滤是借助于过滤介质将大小不同、形状 不同的物质分离的技术。 常用介质：滤纸、滤布、纤维、多空陶瓷， 高分子膜等材料。其中以各种高分子膜为 过滤介质的过滤称为膜分离技术。 根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同， 过滤分为：粗滤、微滤、超滤和反渗透。
三、酶的分离纯化



沉淀分离 离心分离 过滤与膜分离 层析分离 电泳分离 萃取分离
沉淀分离

通过改变某些条件，使溶液中某些溶质的 溶解度降低，从而使酶或杂质从溶液中沉 淀析出，达到与其他溶质分离的效果。

常用方法：盐析沉淀、等电点沉淀、有机 溶剂沉淀、复合沉淀、选择性变性沉淀等。


有机溶剂提取 含非极性基团较多的酶，难溶于水，易 溶于有机溶剂。如乙醇、丙酮等有机溶剂 水溶液。 琥珀酸脱氢酶采用丁醇提取，效果良好。 R酶类可采用90％苯酚水溶液。
酶提取过程的注意事项：
温度 0－10℃ pH 在保持酶活性的前提下，偏离等电点 提取液的体积 含酶原料体积的3-5倍，分次提取 时间 延长提取时间 搅拌 有利于酶分子在两相中的分配 大小 颗粒小，有利于提高扩散速度 添加保护剂 提高酶稳定性 酶作用底物，辅酶，抗氧化剂等
热稳定性好的酶，可通过热处理，使 大多数蛋白质变性后沉淀并除去。例如： α －淀粉酶。
离心分离

离心 利用离心机旋转所产生的离心力， 使不同大小，密度的物质分离的技 术。
视频演示

离心机种类 分离形式：沉降式 过滤式 操作方式：间歇式 连续式 半连续式 用 途：分析用 制备用 分析-制备两用 结构特点：管式 吊蓝式 碟式 转鼓式 转 速：常速 高速 超速
离心机
低速台式离心机 高速冷冻离心机
超速冷冻离心机
不同型号转子和离心管
离心方法的选择

差速离心 采用不同的离心速度和离心时间，使沉降 速度不同的颗粒分批分离的方法。

密度梯度离心
样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数
比较接近的物质得以分离的一种区带分离方法。 配制好适合的密度梯度系统。 常用介质：蔗糖、甘油。 蔗糖浓度：5％－60％，密度范围：1.02-1.30g/cm3