六种常见口腔微生物培养

常见口腔微生物培养

【摘要】变形链球菌、血链球菌、乳杆菌、粘性放线菌、中间普氏菌、白色念珠菌是常见的口腔致龋菌。本实验主要作为大实验的一部分，以标准株为培养对象，设置了各种细菌的普通培养法以及外加原卟啉的培养基培养法。

【关键词】变形链球菌血链球菌乳杆菌粘性放线菌中间普氏菌白色念珠菌培养

1材料与仪器

1.1菌株选择

变形链球菌A TCC 25175

血链球菌A TCC 10556[1]

嗜酸乳杆菌A TCC 4356[1][3]

粘性放线菌A TCC 15987[2]

中间普氏菌A TCC 25611[2]

白色念珠菌A TCC 90038

1.2试剂与培养基

1.2.1磷酸缓冲液PBS

1.2.2无原卟啉培养液：

BHI液体培养基：将3.65gBHI粉末溶于100ml纯水中，待溶解后调pH7.0，高压灭菌，4℃冰箱保存备用。[3]

BHI 平板：3.65g BHI 粉末、2.0g 琼脂溶解于100ml纯水中，待溶解后调pH7.0，高压灭菌，4℃冰箱保存备用。

MRS 液体培养基：3.8g MRS 粉末溶解于100ml纯水中，调pH 6.6，高压灭菌，4℃保存备用。[3]

MRS 平板：3.8g MRS 粉末溶解于100ml纯水中，加入2g琼脂，调pH 6.6，高压灭菌，4℃保存备用。

SDA培养基：蛋白胨1g，葡萄糖4g，琼脂2g 加蒸馏水至100mL，调节至pH6.2 左右，121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后加青霉素（50μg/ml），倒板，置4℃备用。[4] YPD液体培养基：蛋白胨2g，葡萄糖2g，酵母粉1g 加蒸馏水至100mL，调节至pH6.5，121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后加青霉素（50μg/ml），置4℃备用。[4]

1.2.3加原卟啉培养液：

1.2.3.1取0.5g原卟啉IX（亦可以换成锌原卟啉或者原卟啉二钠盐等形式）[5][6]，加水定容到500ml，配制成1g/L的溶液

1.2.3.2在以上各种液体培养基中再加入0.3ml，1g/L的原卟啉溶液配成约3μg/L的培养基。

【注：BHI配方表：每100ml水加入牛心浸出液25ml，牛脑浸出液20ml，胰蛋白胨1.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖0.2g，盐酸半胱氨酸溶液0.4ml，VPI盐液5.0ml，刃天青（0.1%）5.0ml。[2]

MRS培养液配方：每100ml纯水加入胰蛋白胨1.0g，牛肉膏1.0g，酵母提取物0.5g，柠檬酸铵0.2g，葡萄糖0.2g，醋酸钠0.5g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸镁0.058g，硫酸锰0.025g，加入吐温-80 ，0.1 ml.[3]

本实验采用简易的混合粉直接配制。】

1.3培养环境

无菌、厌氧（85%N2，10%H2、5%CO2）,37℃[1]

1.4主要仪器

厌氧培养箱（Bugboxdual，America）

无菌操作台

2培养

2.1变形链球菌培养

2.1.1用固体培养基分离纯化

用接种环取变形链球菌A TCC 25175接种于BHI固体培养基，37℃培养24小时。

2.1.2扩大培养

挑取单菌种分别接种到无原卟啉的BHI液体培养基与含原卟啉的BHI液体培养基，37℃恒温培养24小时。

2.2血链球菌培养

分离提纯并扩大培养血链球菌A TCC 10556，步骤同2.1。

2.3粘性放线菌培养

分离提纯并扩大培养粘性放线菌A TCC 15987，步骤同2.1。

2.4中间普氏菌培养

分离提纯并扩大培养中间普氏菌A TCC 25611，步骤同2.1。

2.5乳杆菌培养

2.5.1用固体培养基分离纯化

用接种环取。。

2.5.2扩大培养

挑取单菌种分别接种到无原卟啉的MRS液体培养基与含原卟啉的MRS液体培养基，37℃恒温培养24小时。

2.6白色念珠菌培养

2.6.1用固体培养基分离纯化

用接种环取白色念珠菌A TCC 90038接种于SDA固体培养基，37℃培养24小时。2.6.2扩大培养

挑取单菌种分别接种到无原卟啉的YPD液体培养基与含原卟啉的YPD液体培养基，37℃恒温培养24小时。

【参考文献】

[1]陶睿. Pleurocidin及其优化多肽抑制常见致龋菌的研究[D].第四军医大学,2012.

[2]杨暤. 茶多酚联用奥硝唑对牙周可疑致病菌的体外抑菌活性研究[D].重庆医科大学,2012.

[3]王勤花. 乳酸杆菌对变形链球菌体外作用研究[D].重庆医科大学,2012.

[4]郑璐. 白色念珠菌生物被膜体外模型的建立及分析[D].重庆医科大学,2010.

[5]王自明,张阳德,何剪太,林伶. 药物诱导大鼠大肠癌组织原卟啉Ⅸ积聚的定量分析[J]. 中国现代医学杂志,2010,01:38-41.

[6]黄维,李元娜,刘倩,吴海龙,李耀群. 两种荧光方法分析血样中锌原卟啉和原卟啉[J]. 分析化学,2009,08:1142-1146.