实验七--胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇Word版
血清胆固醇测定实验报告
一、实验目的1. 了解血清胆固醇测定的原理和意义。
2. 掌握血清胆固醇测定的方法。
3. 熟悉实验操作步骤和注意事项。
二、实验原理血清胆固醇是指血液中所有脂蛋白所含胆固醇之和，包括游离胆固醇和胆固醇酯。
胆固醇是人体内重要的生物活性物质，参与细胞膜的构成、激素的合成、维生素D 的生成等生理过程。
血清胆固醇水平与心血管疾病、动脉粥样硬化等疾病的发生密切相关。
血清胆固醇测定通常采用酶法，其中胆固醇氧化酶法是临床上最常用的方法。
该方法利用胆固醇氧化酶将胆固醇氧化成胆烷4烯3酮，再通过过氧化氢、4-氨基安替比林和酚的作用生成红色醌亚胺，颜色的深浅与标本中胆固醇含量呈正比。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：血清样本、胆固醇标准溶液、胆固醇氧化酶试剂、过氧化氢、4-氨基安替比林、酚、蒸馏水等。
2. 仪器：721型分光光度计、移液器、试管、试管架、恒温水浴箱等。
四、实验步骤1. 标准曲线的绘制（1）取6个试管，分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL胆固醇标准溶液。
（2）向各试管中加入1mL胆固醇氧化酶试剂，混匀后置于37℃恒温水浴箱中保温15min。
（3）取出试管，加入0.1mL过氧化氢、0.1mL 4-氨基安替比林和0.1mL酚，混匀后静置5min。
（4）以蒸馏水调零，于510nm波长处测定吸光度，以胆固醇浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
2. 样本测定（1）取3个试管，分别加入0.5mL血清样本、0.5mL胆固醇氧化酶试剂，混匀后置于37℃恒温水浴箱中保温15min。
（2）取出试管，加入0.1mL过氧化氢、0.1mL 4-氨基安替比林和0.1mL酚，混匀后静置5min。
（3）以蒸馏水调零，于510nm波长处测定吸光度。
（4）根据标准曲线计算血清胆固醇浓度。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制以胆固醇浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，结果如下：胆固醇浓度（mg/dL） | 吸光度---------------------|--------0 | 0.0000.5 | 0.1201.0 | 0.2401.5 | 0.3602.0 | 0.4802.5 | 0.6002. 样本测定根据标准曲线计算血清胆固醇浓度，结果如下：血清样本1：5.20mg/dL血清样本2：4.80mg/dL血清样本3：6.00mg/dL六、实验结论本次实验采用胆固醇氧化酶法成功测定了血清胆固醇浓度，结果与正常参考值相符。
血清总胆固醇TC测定操作规程
血清总胆固醇TC测定操作规程.docx血清总胆固醇（TC）测定操作规程1. 目的本操作规程旨在规范血清总胆固醇（TC）的测定过程，确保检测结果的准确性和重复性。
2. 原理血清总胆固醇（TC）测定通常采用酶法，通过胆固醇酯酶将胆固醇酯水解为游离胆固醇，然后利用胆固醇氧化酶将游离胆固醇氧化为胆甾酮和H2O2，最后利用过氧化物酶将H2O2分解为2H2O和O2，同时产生颜色变化。
颜色的深浅与血清中胆固醇含量成正比，可通过比色法测定。
3. 试剂和材料酶试剂盒（含胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶等）校准品和质控品血清样本蒸馏水移液枪及吸头比色杯恒温水浴箱自动生化分析仪或分光光度计4. 操作步骤4.1 准备工作确保所有试剂和样本均已在室温下平衡至25°C。
校准生化分析仪或分光光度计至适当的波长（通常为500-550nm）。
4.2 试剂准备根据试剂盒说明书，将酶试剂混合均匀，并预热至25°C。
4.3 样本处理取适量的血清样本，避免溶血和脂血样本。
如有必要，对样本进行离心，去除沉淀物。
4.4 加样使用移液枪准确取样，将血清样本加入比色杯中。
按照试剂盒说明书，加入等量的酶试剂至每个比色杯中。
4.5 反应将比色杯放入恒温水浴箱中，保持37°C反应一定时间（通常为5-10分钟）。
4.6 比色测定将反应后的比色杯放入自动生化分析仪或分光光度计中。
读取吸光度值，并根据标准曲线计算血清总胆固醇浓度。
5. 质量控制每次测定前，使用校准品进行仪器校准。
定期使用质控品进行质量控制，确保结果的准确性和稳定性。
6. 结果记录与报告记录所有测定结果，包括吸光度值、胆固醇浓度等。
根据医院或实验室的标准操作程序，编写并发布检测报告。
7. 安全注意事项操作时应穿戴适当的个人防护装备，如手套和实验服。
避免接触试剂和样本，尤其是避免吸入和摄入。
按照当地法规处理废弃物。
8. 维护和校准定期对生化分析仪或分光光度计进行维护和校准，确保仪器的准确性。
血清总胆固醇测定标准操作规程
血清总胆固醇测定标准操作规程1.检验原理：（氧化酶法）血清中总胆固醇（TC ）包括游离胆固醇（FC ）和胆固醇酯（CE ）两部分。
血清中胆固醇可被脂蛋白酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸（FFA ），胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成胆甾烯酮和过氧化氢，过氧化氢在4-氨基安替比林和对羟基苯甲酸钠存在时，晶过氧化物酶（POD ）催化，反应生成苯醌亚胺非那腙的红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中TC 含量成正比。
胆固醇酯+22O H −−−→−胆固醇酯酶胆固醇+脂肪酸 胆固醇+2O −−−−→−胆固醇氧化酶胆甾烯酮+22O H 222O H +4-AA+对羟基苯甲酸钠−−→−POD红色醌类物质+422O H 2.试剂主要组成成分3.样本要求：新鲜无溶血血清。
在22～25℃保存8小时，2～8℃保48小时，-20℃可保存1年。
样本应避免反复冻融！4.检验方法；仪器法（详见DF-603/DI-600标准操作规程） 5参考范围：6.检验结果的解释：6.1样本含量超出线性范围时，建议用0.9%（W/V）的氯化钠溶液稀释样本。
6.2.单位换算：mg/dl=mmol/L×38.77.检验方法的局限性7.1结果的准确性依赖于仪器的校正和测定温度、时间的控制。
7.2若试剂浑浊，或以水空白在500nm处吸光度大于0.080时不能使用。
8.试剂性能指标8.1试剂外观：无色透明或淡黄色液体，无悬浮物及沉淀。
8.2装量：不低于标识值。
8.3空白吸光度：在500nm处，光径1cm时，空白吸光度A≤0.0808.4线性区间：试剂的线性区间为[0.5-20.0]mmol/L，在此线性区间内：a）线性相关系数r应不小于0.9900；b)[2.0-20.0]mmol/L区间内，线性相对偏差不超过±10%。
8.5准确度：使用具有溯源性的标准品进行测定，实测值与标识值的相对偏差应在±10%内。
8.6分析灵敏度：在500nm处，光径1cm时，测量已知浓度样品换算成1mmol/L 的总胆固醇时，吸光度变化△Ammol/L≥0.0028.7批内精密度：CV≤4.0%8.8批间差：R≤6.0%8.9稳定性：（2-8）℃下，原包装存放的试剂有效期为12个月.取到期后1个月的试剂进行测试，应满足1-8.7的要求。
血清总胆固醇的测定(胆固醇氧化酶法)
化，显色与比色五个阶段。目前临床上常用的是
胆固醇氧化酶法
化学法的种类很多，由于显色反应的特异性不同，其结果有一定 的差异。
Abell-Kendall(L-B反应)法
（化
公学
认测
）定
显色稳定
法
三氯化铁-硫酸反应法（Zak法） 操作简便
灵敏度约5倍于L-B反应
法
特异性差，干扰因素比L-B法多 。Zak法更适合于科研使用 。胆固醇酯与游离胆固醇显 色程度比较接近
（mmol/l）
• 参考值 • 3.0-5.20mmol/l。危险阈值：5.20-6.20mmol/l 。
高胆固醇血症：>=6.20mmol/l
思考题
• （1）血红蛋白，胆红素，维生素c对本实验结果
有干扰，原因是什么？
• （2）试查文献说明胆固醇的定量测定还有哪些方
法？每种方法的原理是什么？
• （3）基础液配置中胆酸钠的作用是什么?
表7-7血清总胆固醇的测定
项目
血清/μL
胆固醇标准 液/μL 蒸馏水/μL
酶试剂/μL
测定管
50
—
— 1.50
标准管 — 50
— 1.5水浴中保温15分钟，用空白
管调零，在500nm波长处测吸光度。
• 计算公式： 血清总胆固醇=A测定/A标准 x5.17
临床意义动脉粥样硬化原发性高血脂症贫血败血症甲状腺功能亢进实验目的血清中总胆固醇游离胆固醇游离脂肪酸低密度脂蛋白高密度脂蛋白极低密度脂蛋白乳糜微粒测定方法化学法
血清总胆固醇的测定 （胆固醇氧化酶法）
主讲人：刘杰
同组人（刘杰、杨宇光、陈琪、刘婷婷）
我们为什么要做这个实验呢？
• 化验介绍：血清胆固醇是血脂的成分之一，
血清总胆固醇浓度测定(精)
胆固醇氧化酶法 测定血清总胆固醇
实验原理
游离胆固醇(FC) 血清总胆固醇(TC)
胆固醇酯(CE)
1. 胆固醇酯
胆固醇酯酶
37℃水浴
游离胆固醇 ＋ 游离脂肪酸
胆固醇氧化酶
2. 胆固醇
Δ4-胆甾烯酮＋ H2O2
3. 2H2O2＋4-氨基安替比林＋酚
过氧化物酶
37℃水浴
苯醌亚胺非那腙＋4H2O
(红色，500nm波长)
计算：
测定管浓度 测定管吸光度=
标准管浓度 标准管吸光度
测定管吸光度
测定管浓度＝
× 标准液浓度
标准管吸光度
（血清TC）
操作步骤
1 按下表加样(试管应做好标记)
加入物(μl) 空白管
血清
—
胆固醇标准液 —
蒸馏水
20
酶试剂
1000
标准管 — 10 10 1000
测定管 20 —
20
—
试剂1
1000
1000
试剂2
1000
1000
测定管 20 — —
1000 1000
2 混匀，沸水浴15分钟 3 常温冷却5分钟 4 520nm波长比色，空白管调零，读出吸光度 5 计算：
血清尿素(mmol/L)= A测定 ×10 mmol/L A标准
参考范围：兔血清尿素2.86～8.20 mmol/L
1000
• 混匀，37oC保温5分钟
• 在试管中加入1ml蒸馏水
• 500nm波长比色，空白管调零，读出吸光度
• 计算：
血清TC(mmol/L)= A测定 ×5.17mmol/L
A标准
2
兔血清TC参考值：0.77～2.00 mmol/L
血清总胆固醇测定实验报告
血清总胆固醇测定实验报告一、实验目的血清总胆固醇（Total Cholesterol，TC）测定是临床生化检验中的常见项目之一，本实验旨在掌握血清总胆固醇测定的原理、方法和操作步骤，熟悉实验过程中的注意事项，并对实验结果进行准确分析和判断。
二、实验原理目前，血清总胆固醇测定常用的方法是酶法。
其原理是胆固醇酯酶（CE）将胆固醇酯水解为游离胆固醇（FC）和脂肪酸，胆固醇氧化酶（COD）将 FC 氧化为胆甾烯酮和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶（POD）的催化下与 4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应生成红色醌亚胺。
在一定波长下，通过比色法测定吸光度，从而计算出血清总胆固醇的含量。
三、实验材料与设备1、材料血清样本：新鲜无溶血、无脂浊的血清。
试剂盒：包含胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林、酚等试剂。
2、设备分光光度计移液器恒温水浴箱离心机四、实验步骤1、样本处理空腹采集静脉血，置于干燥无抗凝剂的试管中，室温下静置 30 分钟使其凝固。
以 3000 转/分钟离心 10 分钟，分离血清，备用。
2、试剂准备按照试剂盒说明书的要求，将试剂 R1 和试剂 R2 分别配制好，并放置于恒温水浴箱中预热至规定温度。
3、测定操作取两支干净的比色管，分别标记为空白管和测定管。
空白管中加入蒸馏水20μL 和试剂R1 1000μL，混匀，置于 37℃恒温水浴箱中保温 5 分钟。
测定管中加入血清样本20μL 和试剂R1 1000μL，混匀，置于 37℃恒温水浴箱中保温 5 分钟。
然后，向空白管和测定管中分别加入试剂R2 500μL，混匀，置于37℃恒温水浴箱中保温 10 分钟。
4、比色测定以空白管调零，在分光光度计 500nm 波长处读取测定管的吸光度值（A）。
五、实验结果计算血清总胆固醇（mmol/L）＝（测定管吸光度空白管吸光度）×校准品浓度÷校准管吸光度六、实验结果本次实验测定的血清总胆固醇结果为_____mmol/L。
血清总胆固醇的测定实验报告
血清总胆固醇的测定实验报告胆固醇是人体内一种重要的脂质物质，它在维持细胞膜的完整性、合成激素和胆汁酸等方面发挥着重要作用。
然而，过高的血清总胆固醇水平会增加心脑血管疾病的风险。
因此，及时测定血清总胆固醇水平对于预防和治疗心脑血管疾病具有重要意义。
本实验旨在通过测定血清中总胆固醇的含量，掌握其测定方法，并了解不同因素对血清总胆固醇含量的影响，为临床诊断和研究提供参考。
1. 实验原理。
本实验采用酶法测定血清总胆固醇含量。
首先，将血清样本与试剂中的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶发生反应，将胆固醇酯水解成游离的胆固醇和脂肪酸，然后游离的胆固醇与试剂中的胆固醇氧化酶再次发生反应，生成过氧化物酶，最终生成带有颜色的化合物。
通过测定产生的有色产物的光密度，即可计算出血清中总胆固醇的含量。
2. 实验步骤。
（1）取适量血清样本，离心沉淀，取上清液备用。
（2）将标准品和上清液分别加入反应管中，加入试剂A和试剂B，混匀后放置37℃恒温水浴中反应一定时间。
（3）加入硫酸后，混匀放置10min，再加入试剂C混匀后放置2min。
（4）测定吸光度值，并根据标准曲线计算出血清总胆固醇的含量。
3. 实验结果。
通过实验测定，得出不同血清样本中总胆固醇的含量分别为X mg/dL、Ymg/dL和Z mg/dL。
根据实验结果，我们可以得出……（根据实验结果进行分析和讨论）。
4. 实验结论。
本实验通过酶法测定了血清中总胆固醇的含量，结果表明……（根据实验结果进行结论）。
5. 实验注意事项。
（1）在实验过程中，要注意血清样本的保存和处理，避免样本受到污染或变质。
（2）在试剂配制和使用过程中，要按照相关操作规程，严格控制试剂的质量和使用量。
（3）实验操作过程中，要注意实验室安全，避免发生意外。
6. 实验意义和应用。
本实验方法可以准确测定血清中总胆固醇的含量，为临床诊断和研究提供了重要的参考数据。
同时，也为进一步研究血清总胆固醇与心脑血管疾病的关系提供了实验基础。
胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇
胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇（标准管法）实验目的：1.了解自动生化分析仪的工作原理2.熟悉血清总胆固醇相关生化的检测项目及检测方法3.掌握血清总胆固醇相关生化检测项目的临床意义。
实验原理：胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇:血清中的胆固醇由游离胆固醇及胆固醇酯构成，胆固醇酯在胆固醇酯酶的作用下水解为胆固醇，再与胆固醇氧化酶作用产生△4-胆甾烯酮及H202;后者在过氧化物酶的作用下，与苯酚及4-氨基安替比林作用生成红色化合物醌亚胺。
测定该红色化合物在500nm波长的吸光度，可以计算出血清总胆固醇含量。
实验操作：1.将准备好的酶工作液（胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、苯酚、4-氨基安替比林）加入空白管、浓度标准管、测定管各1.5ml，再向标准管加20μl胆固醇标准液（5.18mmol/L），再向测定管加入20μl血清。
2.将三支试管放入水浴锅中，37℃保温20分钟3.调节分光光度计波长500nm,透光度T至100%，将空白管试液对光的吸收调节为0，再用空白管调“零”点测定其他各管的吸光度。
实验结果:分光光度计测得标准管吸光度和测定管吸光度，根据朗伯-比尔定律,得到血清样品总胆固醇值=（测定管吸光度/标准管吸光度）x5.18分析讨论：为什么用酶酚混合液作为空白管溶液？酶酚混合液作为空白试剂，调节分光光度计透光度T至100%，可将酶酚混合液对光的吸收调节为0，从而消除对葡萄糖反应产物吸光度测定的影响。
思考题：1.血清甘油三酯升高有和临床意义？血脂代谢紊乱对机体有何危害？血清甘油三酯升高可能代表着各种疾病的发生：如原发性继发性高脂蛋白血症、动脉粥样硬化、糖尿病、肾病、脂肪肝等。
血脂代谢紊乱对机体的危害：血脂代谢紊乱的影响分两种：1）高胆固醇血症引起的危害：主要是动脉粥样硬化，包括大动脉、中动脉、小动脉动脉硬化。
动脉斑块形成主要表现在心、脑、肾等位置，如果动脉硬化斑块较重或者不稳定，发生在心脏可出现急性心肌梗死；在脑血管会出现急性脑血栓，即急性脑梗死，以及肾脏出现急性肾梗死；在外周血管，如腿部可引起坏疽；2）高甘油三酯血症引起的危害：在暴饮暴食的情况下，高甘油三酯可以诱发急性胰腺炎。
胆固醇测定实验报告
本次实验旨在通过学习血清总胆固醇（Total Cholesterol，TC）的测定方法，掌握酶法测定胆固醇的原理和操作步骤，并了解血清总胆固醇在临床诊断中的应用。
二、实验原理血清总胆固醇的测定采用酶法，利用胆固醇酯酶将胆固醇酯水解为胆固醇和脂肪酸，再利用胆固醇氧化酶将胆固醇氧化为胆汁酸，同时生成过氧化氢。
在过氧化氢的作用下，加入的4-氨基安替比林和酚酞在酸性条件下生成红色化合物，其颜色深浅与胆固醇含量成正比。
通过比色法测定吸光度，即可计算出血清中胆固醇的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 血清样品- 胆固醇酯酶试剂- 胆固醇氧化酶试剂- 4-氨基安替比林试剂- 酚酞试剂- 磷酸缓冲液- 96孔微孔板- 吸量器- 酶标仪2. 实验仪器：- 恒温水浴锅- 离心机- 移液器- 烧杯- 移液管1. 准备工作- 将所有试剂和器材准备好，并确保其清洁、干燥。
- 将血清样品进行编号，并在实验过程中注意避免交叉污染。
2. 样品处理- 取一定量的血清样品，按照实验要求进行稀释。
- 将稀释后的血清样品加入微孔板中，每孔加入一定量的胆固醇酯酶试剂。
3. 酶反应- 将微孔板放入恒温水浴锅中，在37℃下孵育一定时间，使胆固醇酯酶与胆固醇发生反应。
4. 洗板- 将微孔板取出，用去离子水冲洗3次，以去除未反应的酶和底物。
5. 添加试剂- 向每个微孔中加入一定量的胆固醇氧化酶试剂、4-氨基安替比林试剂和酚酞试剂。
- 加入磷酸缓冲液，使溶液pH值保持在酸性范围内。
6. 比色- 将微孔板放入酶标仪中，在特定波长下测定吸光度。
- 将吸光度值与标准曲线进行对比，计算出血清中胆固醇的含量。
7. 结果分析- 根据实验结果，分析血清总胆固醇水平与临床诊断的关系。
五、实验结果与分析1. 实验结果- 根据实验数据，绘制标准曲线，并计算出样品中胆固醇的含量。
2. 结果分析- 通过实验结果，了解血清总胆固醇水平与临床诊断的关系，为临床诊断提供依据。
血清总胆固醇测定实验报告
血清总胆固醇测定实验报告背景介绍：总胆固醇（TC）是指血浆中所有脂蛋白的胆固醇总和，包括低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C）。
总胆固醇水平的高低与心血管疾病的发生密切相关，因此对其进行准确测定具有重要的临床意义。
实验目的：通过本实验，掌握血清总胆固醇的测定方法，了解其在临床诊断中的应用。
实验原理：本实验采用酶法测定血清总胆固醇，其原理为将胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶加入样本中，将胆固醇和脂蛋白水解为游离胆固醇和过氧化物，再由过氧化物与酚类物质发生反应，生成有色产物，最后通过比色计测定其吸光度，从而计算出总胆固醇的含量。
实验步骤：1. 取血清标本，离心分离血清。
2. 用标准吸光度计预热，设置波长为500nm。
3. 取适量样本和对照品，加入试剂A和试剂B，混匀后在37°C恒温水浴中反应15分钟。
4. 加入试剂C混匀，再在37°C恒温水浴中反应5分钟。
5. 用比色计在波长为500nm处对样本和对照品吸光度，计算总胆固醇含量。
实验结果：样本A吸光度为0.6，对照品吸光度为0.3，根据标准曲线计算出样本A的总胆固醇含量为5.0mmol/L。
样本B吸光度为0.7，对照品吸光度为0.4，计算出样本B的总胆固醇含量为6.0mmol/L。
实验结论：根据上述实验结果，样本A的总胆固醇含量正常，而样本B的总胆固醇含量超标，提示可能存在心血管疾病的风险。
因此，血清总胆固醇的测定对于心血管疾病的筛查和诊断具有重要意义，有助于及时采取预防和治疗措施。
总结：通过本次实验，我们掌握了血清总胆固醇的测定方法及其临床意义，了解了其在心血管疾病中的重要性。
在临床实践中，我们应该重视血清总胆固醇的监测，及时发现异常情况并采取相应的干预措施，以保障患者的健康。
血清胆固醇实验报告
一、实验目的1. 熟悉血清胆固醇测定的原理和方法。
2. 掌握血清胆固醇测定的操作步骤。
3. 了解血清胆固醇与人体健康的关系。
二、实验原理血清胆固醇是血液中所有脂蛋白所含胆固醇之总和，包括游离胆固醇和胆固醇酯。
血清胆固醇的测定对于预防、诊断和治疗心血管疾病具有重要意义。
本实验采用氧化酶法测定血清胆固醇含量。
氧化酶法测定血清胆固醇的原理是：胆固醇在氧化酶的作用下，与氧化剂反应生成过氧化氢，过氧化氢再与邻苯二胺反应，生成有色产物。
有色产物的颜色深浅与血清中胆固醇含量成正比，通过比色法测定吸光度，即可计算出血清胆固醇含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 血清标本- 胆固醇氧化酶试剂- 邻苯二胺试剂- 空白试剂- 标准胆固醇溶液- 比色皿- 比色计2. 实验仪器：- 移液器- 离心机- 恒温水浴锅四、实验步骤1. 标准曲线绘制：- 将标准胆固醇溶液用蒸馏水稀释成不同浓度（如：0、1、2、3、4、5mg/dL）。
- 每个浓度分别加入胆固醇氧化酶试剂、邻苯二胺试剂和空白试剂，充分混匀。
- 将混合液放入恒温水浴锅中，反应一定时间（如：30分钟）。
- 用比色计测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品测定：- 将血清标本用蒸馏水稀释成一定浓度。
- 按照标准曲线绘制步骤，进行操作。
- 测定吸光度，根据标准曲线计算血清胆固醇含量。
3. 结果分析：- 对实验数据进行统计分析，得出血清胆固醇含量的平均值、标准差和变异系数。
- 分析实验误差来源，提出改进措施。
五、实验结果1. 标准曲线绘制结果：- 绘制标准曲线，线性相关系数R²为0.998，表明实验结果可靠。
2. 样品测定结果：- 血清胆固醇含量测定结果为（X±SD）mmol/L，其中X为血清胆固醇含量，SD 为标准差。
3. 结果分析：- 通过统计分析，得出本次实验的血清胆固醇含量与参考值（正常范围为2.86-5.17mmol/L）进行比较，判断是否处于正常范围。
血清总胆固醇测定法
血清总胆固醇测定法1.实验原理胆固醇酯被胆固醇酯酶水解酶(CEH)水解成游离胆固醇，后者被胆固醇氧化酶(COD)氧化成胆甾烯酮并产生过氧化氢，再经过氧化物酶(POD)催化，使4-氨基安替比林与酚（三者合称PAP）反应，生成红色醌亚胺色素（Trinder反应）。
醌亚胺的最大吸光度在500nm左右，吸光度与标本中TC含量成正比。
反应式如下：CEH胆固醇酯+ H2O 胆固醇＋脂肪酸COD胆固醇＋O2Δ4-胆甾烯酮＋H2O2POD2H2O2+ 4-AAP +酚苯醌亚胺(显色) + 4H2O 2. 标本：2.1 病人准备：12小时禁食。
2.2 类型：血清，肝素或EDTA抗凝血浆。
3. 标本存放：血清稳定性：20～25℃保存可稳定1周；4～8℃保存可稳定1周；-20℃保存可稳定3个月。
4. 标本运输：常温条件下保存运输。
5. 标本拒收标准：细菌污染的标本。
6. 实验材料6.1 试剂欧泰克总胆固醇试剂盒（货号：112 1307170 1 试剂8×70ml）6.1.1 试剂组成Tris缓冲液pH7.3 50mmol/L酚20mmol/L4-氨基安替比林 1.0mmol/L 胆固醇酯酶(CHE) ≥400U/L 胆固醇氧化酶(CHO) ≥200U/L 过氧化物酶(POD) ≥4000U/L 6.1.2 试剂准备试剂为即用式。
6.1.3 试剂稳定性与贮存：试剂保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。
试剂不可冰冻。
6.1.4 变质指示：当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。
6.1.5 注意事项：试剂中含叠氮钠（0.95g/L）为防腐剂。
不可入口！避免接触皮肤及粘膜。
应采取必要的预防措施使用试剂6.2 校准品：使用罗氏复合校准品对自动分析仪进行校准，具体参见生化检验校准品和质控品.SOP文件。
6.3 质控品：具体参见生化检验校准品和质控品.SOP 文件。
胆固醇氧化酶的三相分离及 其血清总胆固醇的测定
第39卷第2期西南师范大学学报(自然科学版)2014年2月V o l.39N o.2 J o u r n a l o f S o u t h w e s t C h i n aN o r m a lU n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c eE d i t i o n)F e b.2014文章编号:10005471(2014)2000109胆固醇氧化酶的三相分离及其血清总胆固醇的测定①王琼,霍影,汪静,张清燕,任尧,葛方兰四川师范大学生命科学学院,成都610101摘要:对一株胞外胆固醇氧化酶高产菌C O X48进行了三相分离,结果表明:最优分离条件为:硫酸铵异丙醇沉淀,硫酸铵饱和度为70%,异丙醇与发酵上清液的体积比为0.8ʒ1时,p H值为9,在20ħ下静置30m i n,12000 r/m i n离心10m i n,纯化倍数4.5倍,回收率高达95%.酶动力学方法检测胆固醇氧化酶测定血清总胆固醇含量,其线性回归方程为y=0.0064x+0.0027,R2=0.9654,线性范围0~7.16mm o l/L.结果表明了该酶具有作为临床诊断试剂的潜力,并为临床上利用酶动力学方法测定血清总胆固醇含量奠定了实验基础.关键词:胆固醇氧化酶;三相分离;酶动力学方法中图分类号:Q814文献标志码:A胆固醇是脊椎动物细胞膜的重要组成成分,它具有多种多样的生理功能.但是体内过多的胆固醇却是引起冠心病㊁动脉硬化和心肌梗塞的危险因素之一.目前欧美等发达国家冠心病的死亡率已经超过所有癌症死亡率的总和,占总死亡率的27.4%[1].胆固醇氧化酶(C O D)能够催化胆固醇氧化成为胆甾4烯3酮.因此可以用它来检测血液中胆固醇的含量.它可以分解食物中的胆固醇,已经应用在心血管疾病的治疗当中[2-4].另外,它还能有效抑制鳞翅目昆虫的生长繁殖,是一种生物杀虫剂[5].它的氧化产物还具有抗肥胖㊁治疗肝病等疗效[6].三相分离技术(T P P)是将硫酸铵与有机溶剂混合后形成有机相㊁中间沉淀相和水相的原理而用于分离蛋白质的技术.常用于三相分离的有机溶剂有乙醇㊁丙酮㊁异丙醇㊁甲醇等,有机溶剂的用量一般为酶液体积的2倍左右,使用不同的酶和不同的有机溶剂时,有机溶剂的使用浓度都有所不同,同时该技术还受温度和p H的影响[7].本研究采用了实验室保存菌中筛选得到1株胞外胆固醇氧化酶高产菌C O X48,三相分离用于纯化胆固醇氧化酶的最合适的体系是当V(异丙醇)ʒV(发酵上清液)为0.8ʒ1,硫酸铵饱和度为70%;最适提取温度和时间分别为20ħ,30m i n,最适p H值为9.0,并采用酶动力学方法检测胆固醇氧化酶测定血清总胆固醇含量,对其准确性进行了分析.其线性回归方程为y=0.0064x+0.0027,R2=0.9654,线性范围0~7.16mm o l/L.结果表明了该酶具有作为临床诊断试剂的潜力,并为临床上利用酶动力学方法测定血清①收稿日期:20130530基金项目:四川师范大学校级重点资助项目(11K Y L05).作者简介:王琼(1980),女,四川宣汉人,硕士,实验师,主要从事分子微生物学的研究工作.通信作者:葛方兰,硕士,副教授.2西南师范大学学报(自然科学版)h t t p://x b b j b.s w u.c n第39卷总胆固醇含量奠定了实验基础.1材料与方法1.1胆固醇氧化酶的来源四川师范大学分子生物与微生物研究室保存产胆甾4烯3酮的菌株C O X48(R h o d o c o c c u s e s p.)发酵所产的胆固醇氧化酶的粗酶液.1.2主要药品胆固醇(国药)㊁辣根过氧化物酶(国药)㊁T r i t o n X100(进口分装)㊁胆固醇氧化酶(S I GMA)㊁4氨基氨替比林(国药)㊁胆固醇酯酶(实验室保存)㊁测定血清总胆固醇含量的试剂盒(长春汇力生物技术有限公司)㊁人血清标本(四川省第二中医医院).酵母粉㊁大豆蛋白胨(O X O I D)㊁硫酸铵㊁正丙醇㊁异丙醇㊁正丁醇㊁叔丁醇㊁丙酮(均为国产药品).1.3酶活力测定的试剂和工作液1.3.1100ˑ4氨基氨替比林(4A A)溶液称取2.0324g4氨基氨替比林溶于超纯水中,最后定容至100m L,用棕色瓶装,4ħ避光保存.1.3.2100ˑ叠氮钠溶液称取2g叠氮钠溶于超纯水中定容至100m L,用棕色瓶装,4ħ避光保存.1.3.3 A液分别加入1m l100ˑ4A A溶液(终浓度为1mm o l/L),1m L100ˑ叠氮钠溶液(终浓度为0.2g/L), 56μL重蒸酚(终浓度为6mm o l/L),700U辣根过氧化物酶(终浓度为7000U/L),用25mm o l/L㊁p H7.5的磷酸钾缓冲液定容至100m L.1.3.4胆固醇底物溶液(B液)胆固醇需先用碾钵碾细(便于溶解),称取0.1652g胆固醇溶于异丙醇中,同时加入T r i t o n X100(最终体积分数为4.26%)助溶,然后用异丙醇定容至20m L,4ħ密封保存.1.4制作胆固醇标准曲线试剂配制1.4.1 C液[8]4氨基安替比林:0.5mm o l/L;重蒸酚:20mm o l/L;胆酸钠:0.5mm o l/L;辣根过氧化物酶: 10000U/L;磷酸钾缓冲液:0.1m o l/L,p H7.0;T r i t o n X100:9g/L;不同酶活单位的胆固醇氧化酶.1.4.2 D液[8]将一系列不同底物浓度(0~25.6mm o l/L)的底物胆固醇溶于乙醇中,其中加入T r i t o n X100助溶(最终体积分数为20%).2方法2.1胆固醇氧化酶活力测定操作方法[9]:在小试管中取3m LA液与150μLB液混合,37ħ下在恒温水浴锅中保温3m i n,加入50μL粗酶液,迅速混匀,37ħ准确反应5m i n,立即沸水浴3m i n,将试管放于冰水中冷却澄清,于500 n m下测定吸光度.酶活(U/m L)为1.6832ˑA500.2.2酶的分离纯化2.2.1不同硫酸铵饱和度对酶初步纯化收率的影响在粗酶液中加入不同饱和度的硫酸铵(40%~90%),5ħ下静置2h,12000r/m i n,冷冻离心10m i n,收集沉淀,用p H7.5的10mm o l/L的磷酸缓冲液溶解后按照胆固醇氧化酶的测定方法测定酶活和蛋白质浓度.2.2.2 不同有机溶剂对酶初步纯化收率的影响在粗酶液中加入不同体积的有机溶剂(正丙醇㊁异丙醇㊁正丁醇㊁叔丁醇㊁丙酮),5ħ下静置2h ,12000r /m i n 冷冻离心10m i n ,收集沉淀,用p H 7.5的10mm o l /L 的磷酸缓冲液溶解后按照标准方法测定酶活和蛋白质浓度.2.2.3 不同有机溶剂对酶三相分离收率的影响5ħ条件下,在粗酶液中加入饱和度为70%的硫酸铵,待溶解后,将不同体积的不同有机溶液加入,5ħ下静置2h 分为3层,12000r /m i n 冷冻离心10m i n ,收集中间的蛋白相,用p H 7.5的10mm o l /L 的磷酸缓冲液溶解后按照标准方法测定酶活和蛋白质浓度.2.2.4 温度和时间对酶三相分离的影响用2.2.2的结果,改变三相分离体系的抽提温度(5,10,20,25,30,40ħ)和时间(10,20,30,60,90,120m i n ),以上述相同方法收集中间蛋白相测定胆固醇氧化酶的酶活和蛋白质浓度.2.2.5 不同p H 对酶三相分离的影响根据2.2.2和2.2.3的实验结果,对三相分离体系的p H 环境进行优化,改变上清液的p H (4~11),以上述相同方法收集中间蛋白相并测定胆固醇氧化酶的酶活和蛋白质浓度.2.3 血样的采集与处理样本来源:四川省第二中医医院采集胆固醇浓度从高到低的8个血清标本.样本处理:采用静脉采样,同时加入E D T A -N a 2(1m g /m L )的抗凝剂,尽快送实验室,室温放置30~40m i n 后,用冷冻离心,得到血清置于洁净的试管中加盖保存.血清标本在室温中放置不超过3h ,4ħ保存可稳定4d .置-70ħ可长期保存,但不可反复冻融.总胆固醇含量的测定:采用测定血清总胆固醇含量的试剂盒,按照试剂盒测定血清总胆固醇含量的方法(终点法),测定血清标本胆固醇的准确浓度.2.4 动力学方法和终点法测定胆固醇含量2.4.1 终点法直接加入C 液保存3m i n 后,和D 液准确反应10m i n ,然后沸水浴3m i n 终止反应,待澄清后于500n m 下测定吸光度.2.4.2 酶动力学方法直接加入C 液保存3m i n 后,每隔5s 检测一次酶活,最后测出每分钟吸光值的变化.2.5 酶动力学方法的优化2.5.1 酶动力学方法反应体系中胆固醇与反应试剂的比例研究研究发现,在酶动力学反应中,底物在反应体系中的浓度直接影响着胆固醇氧化酶测定胆固醇的准确性,因此在测定血清总胆固醇之前,对反应体系中底物浓度的优化很重要.选取了底物ʒ反应试剂浓度梯度为1ʒ100,1ʒ20,1ʒ10进行比较研究.2.5.2 酶动力学方法中不同的胆固醇氧化酶酶活对线性关系的影响不同的胆固醇氧化酶酶活,在用于测定胆固醇含量时,其准确度也不一样.实验通过比较100U /L ,200U /L ,400U /L ,800U /L 这4个不同的酶活单位,确定一个最佳的测定胆固醇含量的酶活,为酶动力学方法的构建打好基础.2.6 动力学方法测定血清总胆固醇含量的准确度研究2.6.1 胆固醇氧化酶的血清总胆固醇含量标准曲线用制作胆固醇含量标准曲线的动力学方法,以已知总胆固醇含量的血清为底物(浓度0~7.16mm o l/L ),制作该胆固醇氧化酶的血清总胆固醇含量标准曲线,确定该酶采用动力学方法在检测血清总胆固醇含量的准确性.3第2期 王 琼,等:胆固醇氧化酶的三相分离及其血清总胆固醇的测定2.6.2酶动力学反应进程的测定选取2.561mm o l/L和5.2mm o l/L两个总胆固醇浓度的血清样本为底物,测定反应30,60,120,180, 210,240s的吸光值变化.2.7胆固醇氧化酶测定血清总胆固醇含量的精密度的研究方法选取低㊁中㊁高3个总胆固醇浓度的血清样本(2.561,3.953,5.2mm o l/L),1d内分别做6个重复测定该样本的总胆固醇含量,确定该酶的日内精密度;同时连续做6d,每天测定一次该样本的总胆固醇含量,确定该酶的日间精密度;最后对血清总胆固醇含量回收率进行检测,在3个血清样本中加入相同浓度的相同体积的血清,并混合,然后用上述同样的方法检测该样本中胆固醇的含量,最后计算出该胆固醇氧化酶在用于测定血清总胆固醇含量的回收率.3结果3.1不同硫酸铵饱和度对酶初步纯化收率的影响由图1可知,硫酸铵饱和度从40%提高到70%时,回收率和比酶活都大体成上升的趋势;当硫酸铵的饱和度为70%时,沉淀的目的酶蛋白达到最多,回收率达48%,比酶活达1U/m g,发酵上清液的比酶活为0.39U/m g,纯化倍数为2.5倍;随后,开始呈下降的趋势.通过对硫酸铵饱和度的优化,确定其最优的沉淀条件,为后面对三相分离的研究提供了条件.3.2不同有机溶剂对酶初步纯化收率的影响利用丙酮㊁正丙醇㊁异丙醇㊁正丁醇㊁叔丁醇等5种有机溶剂分别纯化胆固醇氧化酶,并对其酶的收率进行检测,结果如下:丙酮沉淀胆固醇氧化酶的结果如图2所示,综合胆固醇氧化酶的回收率和比酶活可知,最优的丙酮沉淀条件是:当V(丙酮)ʒV(发酵上清液)为0.4ʒ1时,酶回收率达到7.27%,比酶活为0.13U/m g,发酵上清液的比酶活为0.18U/m g,纯化倍数为0.69倍.图1硫酸铵饱和度对C O D收率的影响图2丙酮沉淀对C O D收率的影响正丙醇沉淀胆固醇氧化酶的结果如图3所示,综合考虑胆固醇氧化酶的回收率和其比酶活可知,最优的正丙醇沉淀条件是:当V(正丙醇)ʒV(发酵上清液)为0.9ʒ1时,酶回收率达到2.79%,比酶活为0.11 U/m g,发酵上清液的比酶活为0.18U/m g,纯化倍数为0.6倍.异丙醇沉淀胆固醇氧化酶的结果如图4所示,综合考虑胆固醇氧化酶的回收率和比酶活可知,最优的异丙醇沉淀条件是:当V(异丙醇)ʒV(发酵上清液)为0.9ʒ1时,酶回收率达到2.99%,比酶活为0.23 U/m g,发酵上清液的比酶活为0.18U/m g,纯化倍数为1.21倍.正丁醇沉淀胆固醇氧化酶的结果如图5所示,综合考虑该胆固醇氧化酶的回收率和比酶活可知,最优的正丁醇沉淀条件是:当V(正丁醇)ʒV(发酵上清液)为0.9ʒ1时,酶回收率达到1.45%,比酶活为0.18 U/m g,发酵上清液的比酶活为0.18U/m g,纯化倍数为1倍.叔丁醇沉淀胆固醇氧化酶的结果如图6所示,综合考虑胆固醇氧化酶的回收率和比酶活可知,最优的叔丁醇沉淀条件是:当V(叔丁醇)ʒV(发酵上清液)为0.8ʒ1时,酶回收率达到3.68%,比酶活为0.23 4西南师范大学学报(自然科学版)h t t p://x b b j b.s w u.c n第39卷U /m g ,发酵上清液的比酶活为0.18U /m g,纯化倍数为1.2倍.图3 正丙醇沉淀对C O D 收率的影响图4 异丙醇沉淀对C O D 收率的影响图5 正丁醇沉淀对C O D 收率的影响图6 叔丁醇沉淀对C O D 收率的影响3.3 不同有机溶剂对酶三相分离收率的影响对比了丙酮硫酸铵㊁正丙醇硫酸铵㊁异丙醇硫酸铵㊁正丁醇硫酸铵㊁叔丁醇硫酸铵的三相分离对酶回收率的影响,其中使用的硫酸铵饱和度均为70%.希望通过对不同有机溶剂体积进行优化,获得适合用于胆固醇氧化酶纯化的三相分离体系.3.3.1 丙酮硫酸铵沉淀胆固醇氧化酶与收率如图7所示,综合分析胆固醇氧化酶的回收率和比酶活可知,最优的丙酮硫酸铵沉淀条件是:当V(丙酮)ʒV (发酵上清液)为0.5ʒ1时,酶回收率达到51.42%,比酶活为1.22U /m g ,发酵上清液的比酶活为0.31U /m g,纯化倍数为3.1倍.3.3.2 正丙醇硫酸铵沉淀胆固醇氧化酶与收率如图8所示,综合胆固醇氧化酶的回收率和比酶活可知,最优的正丙醇-硫酸铵沉淀条件是:当V (正丙醇)ʒV (发酵上清液)为0.9ʒ1时,酶回收率达到64.26%,比酶活为1.48U /m g ,发酵上清液的比酶活为0.31U /m g,纯化倍数为3.75倍.图7 不同体积的丙酮硫酸铵对C O D收率的影响图8 不同体积的正丙醇硫酸铵对C O D 收率的影响3.3.3 异丙醇硫酸铵沉淀胆固醇氧化酶与收率如图9所示,综合胆固醇氧化酶的回收率和比酶活可知,最优的异丙醇硫酸铵沉淀条件是:当V (异5第2期 王 琼,等:胆固醇氧化酶的三相分离及其血清总胆固醇的测定丙醇)ʒV(发酵上清液)为0.8ʒ1时,酶回收率达到62.27%,比酶活为1.61U/m g,发酵上清液的比酶活为0.31U/m g,纯化倍数为4.09倍.3.3.4正丁醇硫酸铵沉淀胆固醇氧化酶与收率如图10所示,综合胆固醇氧化酶的回收率和比酶活可知,最优的正丁醇-硫酸铵沉淀条件是:当V (正丁醇)ʒV(发酵上清液)为0.9ʒ1时,酶回收率达到59.87%,比酶活为1.24U/m g,发酵上清液的比酶活为0.31U/m g,纯化倍数为3.39倍.图9不同体积的异丙醇硫酸铵对C O D收率的影响图10不同体积的正丁醇硫酸铵对C O D收率的影响3.3.5叔丁醇硫酸铵沉淀胆固醇氧化酶与收率如图11所示,综合胆固醇氧化酶的回收率和比酶活可知,最优的叔丁醇硫酸铵沉淀条件是:当V(叔丁醇)ʒV(发酵上清液)为1ʒ1时,酶回收率达到54.18%,比酶活为1.13U/m g,发酵上清液的比酶活为0.31U/m g,纯化倍数为2.88倍.通过对不同的有机溶剂的体积进行优化比较,得出三相分离用于纯化胆固醇氧化酶的最合适的体系是当V(异丙醇)ʒV(发酵上清液)为0.8ʒ1㊁硫酸铵饱和度为70%时,酶回收率达到62.27%,比酶活为1.61U/m g,发酵上清液的比酶活为0.31U/m g,纯化倍数为4.09倍.这比硫酸铵㊁有机溶剂单独用于沉淀纯化酶时,更有利于生产中胆固醇氧化酶的规模化分离纯化.3.4不同抽提温度和时间对酶三相分离收率的影响采用异丙醇-硫酸铵三相分离方法,以V(异丙醇)ʒV(发酵上清液)为0.8ʒ1㊁硫酸铵饱和度为70%为基础,对三相分离的提取温度和时间进行了优化,结果如图12,最适提取温度和时间分别为20ħ,30 m i n,回收率达81.49%,发酵上清液的比酶活为0.29U/m g,纯化倍数高达4.1倍.图11不同体积的叔丁醇硫酸铵对C O D 收率的影响图12温度和时间对C O D收率的影响3.5不同p H对酶三相分离收率的影响将溶有硫酸铵(饱和度为70%)的发酵上清液的p H从4.0调到11.0,按照上述的最优条件进行胆固醇氧化酶的三相分离纯化的优化,其结果如图13所示,p H从4.0到9.0,该酶的回收率和比酶活都逐渐增大,p H为9.0时,回收率和比酶活都达到最大值,分别为95%和1.87U/m g,纯化倍数高达4.5倍.通过6西南师范大学学报(自然科学版)h t t p://x b b j b.s w u.c n第39卷对酶三相分离体系中的p H 条件进行优化,为胆固醇氧化酶的进一步分离纯化奠定了基础.3.6 用酶动力学方法和酶终点法测定胆固醇含量分别利用胆固醇氧化酶用酶终点法和酶动力学方法测定胆固醇含量,比较分析其准确性,结果如图14所示,从图中两条曲线的线性关系可知,酶动力学方法的曲线接近于直线,在临床上用于测定胆固醇方面准确性更高,具有较好的应用前景.图13 p H 对C O D比酶活的影响图14 终点法和动力学方法测定胆固醇含量的比较3.7 酶动力学方法的优化3.7.1 酶动力学方法反应体系中胆固醇与反应试剂的比例研究对酶动力学方法反应体系中胆固醇溶液与反应试剂体积比进行优化研究,其结果如图15所示.通过对4个不同体积比的线性关系分析可知,在V (底物)ʒV (反应试剂)为1ʒ100的条件下,其线性关系的准确度最高.3.7.2 酶动力学方法中不同的胆固醇氧化酶酶活对线性关系的影响对胆固醇氧化酶酶活对线性关系的影响进行了分析,由图16可知,最优的测定胆固醇标准曲线制作条件是:V (底物)ʒV (反应试剂)为1ʒ100,酶活单位为100U /L ,制作出标准曲线的公式为y =0.0011x +0.0011,变异系数R 2=0.9915,P <0.001.其符合生物统计学的要求.图15 反应体系中胆固醇含量的比例图16 不同的酶活对线性关系的影响3.8 用动力学方法测定血清总胆固醇含量的准确度研究3.8.1 胆固醇氧化酶测定血清总胆固醇标准曲线的制作根据上述结果,用酶动力学方法,在V (底物)ʒV (反应试剂)为1ʒ100,酶活单位为100U /L 的条件下,制作了人体血清总胆固醇含量的标准曲线.通过试验可得,用该酶测定人体血清总胆固醇含量时,结果如图17,制作出标准曲线的公式为y =0.0064x +0.0027,变异系数R 2=0.9654.其准确度较高,测定血清总胆固醇含量的线性范围为0~7.16mm o l /L .3.8.2 酶动力学反应进程的测定测定血清总胆固醇含量的反应进程如图18所示,从反应开始到120s 为反应的延迟期,180s 到240s为该酶的反应初速度.由于该酶初速度的开始时间为反应进行180s 后,历经1m i n,时间较长,便于实验7第2期 王 琼,等:胆固醇氧化酶的三相分离及其血清总胆固醇的测定操作.图17测定血清总胆固醇标准曲线的制作图18反应速率的测定3.9胆固醇氧化酶测定血清总胆固醇含量的精密度研究用酶动力学方法测定血清总胆固醇含量的精密度,如表1所示,日内精密度的变异系数为3.79%;日间精密度的变异系数为4.37%.该酶用于测定血清总胆固醇含量的回收率高达90.9%,因此,该酶在测定血清总胆固醇含量准确度方面有很好的应用前景,通过该研究为临床上的研究提供了更有利的证据.表1C O D日内精密度、日间精密度和回收率的测定评价方法平均值/(mm o l㊃L-1)标准偏差/(mm o l㊃L-1)变异系数/%回收率/%日内精密度(n=6)低2.780.165.89中4.210.133.02高5.670.142.47平均数3.79日间精密度(n=6)低2.960.186.38中4.340.163.77高5.460.162.95平均数4.37回收率(混合)低+中(1+1)82.99低+高(1+1)96.50中+高(1+1)93.21平均数90.904讨论本研究选用丙酮㊁正丙醇㊁异丙醇㊁正丁醇㊁叔丁醇这5种有机溶剂作为三相分离的有机相,用三相分离从乳化发酵液中分离纯化胆固醇氧化酶,优化后的三相分离条件为:在20ħ下,调节发酵上清液的p H 至9.0,加入硫酸铵使其饱和度为70%,溶解后加入异丙醇,并且V(异丙醇)ʒV(发酵上清液)为0.8ʒ1,静置30m i n后分相,12000r/m i n离心10m i n,收集中间蛋白相,用p H7.5的10mm o l/L的磷酸缓冲液溶解后按照标准方法测定酶活和蛋白质浓度.经三相分离纯化后,胆固醇氧化酶的纯化倍数为4.5倍,回收率达95%.结果表明,三相分离技术为胆固醇氧化酶的进一步纯化奠定了基础,同时也为规模化工业生产提供了一种简便而效率高的纯化方法.对该酶的临床应用研究表明,采用动力学方法用该酶测定血清总胆固醇含量,当底物的体积与反应体系的体积比为1ʒ100㊁酶的酶活为100U/L时,制作标准曲线,线性回归方程为y=0.0064x+0.0027, R2=0.9654.其准确度表现为较高,用于测定血清总胆固醇含量范围为0~7.16mm o l/L.同时对该酶测定血清总胆固醇含量的精密度进行了研究,通过做6个日内重复和6个日间重复,结果显示该酶的日内精密度的变异系数为3.79%,日间精密度的变异系数为4.37%.同时该酶用于测定血清总胆固醇含量的回收8西南师范大学学报(自然科学版)h t t p://x b b j b.s w u.c n第39卷率高达90.9%,该酶在测定血清总胆固醇含量准确度方面有很好的应用前景.参考文献:[1]牛天贵,吕 莹,蔡同一,等.降解食品中胆固醇的芽胞杆菌T 12_1的筛选与应用研究[J ].中国农业大学学报,2001,6(1):74-78.[2] 吕陈峰,陈毅力,王龙刚,等.胆固醇氧化酶转化胆固醇制备胆甾4烯3酮[J ].无锡轻工大学学报,2001,20(5):485-488.[3] N A K AM I N AM IT.A m p e r o m e t r i cD e t e r m i n a t i o n o fT o t a l C h o l e s t e r o l a tG o l dE l e c t r o d e sE o v a l e n t l y M o d i f i e dw i t hC h o l -e s t e r o l o x i d a s e a n dC h o l e s t e r o l E s t e r a s ew i t h U s eo fT h i o n i na sa nE l e c t r o n M e d i a t o r [J ].A h a 1.C h e m ,1999,71(5):1068-1076.[4] V O L K E RF W E N D I S H C H ,A L B E R T A D E G R A A F ,H E R MA N N S A HM ,e t a l .Q u a n t i t a t i v eD e t e r m i n a t i o no fM e t a -b o l i c f l u x e sD u r i n g C o u t i l i z a t i o no fT w oC a r b o nS o u r c e s :C o m p a r a t i v e a n a l y s i s w i t h C o r y n e b a c t e r i u m g l u t a m i c u m d u r i n g G r o w t ho nA c e t a t e a n dG l u c o s e [J ].J o u r n a l o f B i o t e c h n o l o g y ,2000,182(11):3088-3096.[5] P U R C E L LJ OHN D ,G R E E N P L A T EJ OHN T ,J E N N I N G S M I C HA E L G ,e t a l .C h o l e s t e r o lX i d a s e :AP o t e n tL a r v a e [J ].B i o c h e m.B i o p h ys .R e s .C o mm u m.1993,196(3):1406-1413.[6] D O U K Y U N.P u r i f i c a t i o no fE x t r a e e l l u l a rC h o l e s t e r o lO x i d a s ew i t h H i g h A c t i v i t y i nt h eP r e s e n c eo fO r g a n i cS o l v e n t s f r o m P s e u d o m o n a s s p .S t r a i nS T -200[J ].A p pl E n v i r o n M i c r o b i o l ,1998,64(5):1929-1932.[7] R O YI P S I T A ,S HA R MA A P A R N A ,N A T HMU N I S HWA R ,e t a l .R e c o v e r y o fB i o l o g i c a l a c t i v i t y i nR e v e r s i b l y I n a c t i -v a t e dP r o t e i n sb y T h r e eP h a s eP a r t i t i o n i n g [J ].E n z y m e a n d M i c r o b i a lT e c h n o l o g y ,2005,37(1):113-120.[8] P O R N P E N S R I S AWA S D I ,P A T C HA R E E J E A R A N A I K O O N ,e ta l .A p p l i c a t i o no fS t r e p t o m y c e sa n dB r e v i b a c t e r i u m -c h o l e s t e r o lO x i d a s ef o rT o t a lS e r u m C h o l e s t e r o lA s s a y b y t h eE n z ym a t i c K i n e t i c M e t h o d [J ].C l i n i c a C h i m i c a A c t a ,2006,372(1/2):103-111.[9] 萨姆布鲁克㊃J ,弗里奇㊃E ,曼尼阿蒂斯㊃T.分子克隆实验指南[M ].2版.金冬雁,黎孟枫,译.北京:科学出版杜,1999.O nD e t e r m i n a t i o no f S e r u mT o t a l C h o l e s t e r o l C h o l e s t e r o lO x i d a s e b y T h r e e -P h a s eP a r t i t i o n i n g a n d i t sC l i n i cA p pl i c a t i o n WA N G Q i o n g , HU O Y i n g , WA N G J i n g,Z HA N G Q i n -y a n , R E N Y a o , G EF a n g -l a n L i f es c i e n c ec o l l e g eo f S i c h u a n n o r m a l u n i v e r s i t y ,S i c h u a n ,C h e n gd u 610101,C h i n a A b s t r a c t :As t r a i no fe x t r a c e l l u l a r c h o l e s t e r o l o x i d a s eh i g hb a c t e r i aC O X 4-8b y t h e t h r e e p h a s e s e pa r a t i o n t e c h n o l o g y h a sb e e n s t u d i e d i n t h i s p a p e r .R e s u l t s s h o wt h a t t h e p Ho f t h e s u p e r n a t a n t i s a d j u s t e d t o 9.0.A mm o n i u ms u l f a t e (s a t u r a t i o n70%)i sa d d e da n dv o r t e x e d g e n t l y ,f o l l o w e db y a d d i t i o no f i s o p r o p a n o l (80%).T h em i x t u r e i s t h e n i nc u b a t ed a t 20ħf o r 30m i n f o r t he t h r e e -p h a s e f o r m a t i o n .T h e s e p h a s e s a r e t h e ns e p a r a t e db y c e n t r i f u g a t i o n a t 12000r /m i n f o r 10m i n .T h e r e s u l t s s h o wt h a t 95%r e c o v e r y o f a c t i v i -t y wi t h4.5f o l d p u r i f i c a t i o n f o r c h o l e s t e r o l o x i d a s eh a s b e e na c h i e v e d .K e y w o r d s :C h o l e s t e r o l o x i d a s e ;t h r e e -p h a s e p a r t i t i o n i n g ;t h e e n z y m a t i c k i n e t i cm e t h o d 责任编辑 周仁惠9第2期 王 琼,等:胆固醇氧化酶的三相分离及其血清总胆固醇的测定。
血清总胆固醇的测定实验报告
血清总胆固醇的测定实验报告一、实验目的。
本实验旨在通过测定血清中的总胆固醇水平，了解被检测者的心血管健康状况，为预防和治疗心血管疾病提供参考依据。
二、实验原理。
血清总胆固醇是指血液中所有脂蛋白和游离胆固醇的总和，通常以毫摩尔/升（mmol/L）为单位进行测定。
在实验室中，我们采用酶法测定血清总胆固醇，即通过酶的催化作用将胆固醇氧化成酮醇，然后通过比色法测定产生的色素来确定总胆固醇的浓度。
三、实验步骤。
1. 采集被检测者的静脉血样本，放置于离心管中，离心10分钟后取上清液。
2. 将上清液放入试剂盒中，按照说明书的操作步骤进行样本处理和试剂添加。
3. 使用分光光度计测定样本吸光度，根据标准曲线计算出血清总胆固醇的浓度。
四、实验结果。
根据实验测定，被检测者的血清总胆固醇水平为X mmol/L。
五、实验分析。
根据血清总胆固醇的测定结果，结合被检测者的年龄、性别、生活方式等因素，可以初步判断其心血管健康状况。
若总胆固醇水平偏高，可能存在心血管疾病的风险，需要进一步进行相关检查和干预措施。
若总胆固醇水平正常，被检测者的心血管健康状况良好。
六、实验注意事项。
1. 在采集血样和进行实验操作时，要严格遵守无菌操作规范，确保实验结果的准确性和可靠性。
2. 实验过程中要注意化学试剂的使用安全，避免接触皮肤和吸入气体，必要时戴上防护手套和口罩。
3. 实验设备的使用和维护要符合相关规定，保证设备的正常运转和数据的准确性。
七、实验结论。
通过本次实验测定，我们成功得出了被检测者的血清总胆固醇水平，并对其心血管健康状况进行了初步分析。
实验结果对于预防和治疗心血管疾病具有一定的参考价值。
八、实验展望。
在今后的实验中，我们将进一步完善实验方法，提高测定精度和准确性，为更多人群的心血管健康提供更多的数据支持和科学依据。
以上就是本次血清总胆固醇的测定实验报告，希望对大家有所帮助。
血清总胆固醇测定实验报告
血清总胆固醇测定实验报告一、实验目的血清总胆固醇（Total Cholesterol，TC）测定是临床生化检验中常见的项目之一。
本次实验的目的是掌握血清总胆固醇测定的基本原理、操作方法和结果分析，了解血清总胆固醇水平在健康评估和疾病诊断中的意义。
二、实验原理目前常用的血清总胆固醇测定方法为酶法。
胆固醇酯酶（CE）首先将胆固醇酯水解为游离胆固醇和脂肪酸，胆固醇氧化酶（COD）催化游离胆固醇氧化生成胆甾烯酮和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶（POD）的作用下与 4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应生成红色醌亚胺化合物。
在 500nm 波长处测定吸光度，吸光度的高低与血清中总胆固醇的含量成正比，通过与标准品比较可计算出血清总胆固醇的浓度。
三、实验材料1、仪器分光光度计恒温水浴箱移液器离心机2、试剂胆固醇测定试剂盒（包括胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林、酚等）标准胆固醇溶液（浓度已知）血清样本四、实验步骤1、试剂准备按照试剂盒说明书将试剂配制成工作液，置于 37℃恒温水浴箱中预温。
2、样本处理采集空腹静脉血，离心分离血清。
3、标准曲线绘制取 5 支试管，分别加入0μl、50μl、100μl、150μl、200μl 标准胆固醇溶液，用生理盐水补足至200μl。
各管中胆固醇的浓度分别为0mmol/L、25mmol/L、50mmol/L、75mmol/L、100mmol/L。
向各管中加入 20ml 工作液，充分混匀，37℃水浴 10 分钟。
以空白管调零，在 500nm 波长处测定各管吸光度。
以胆固醇浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
4、样本测定取200μl 血清样本，加入 20ml 工作液，充分混匀，37℃水浴 10 分钟。
测定样本管的吸光度，根据标准曲线计算出血清总胆固醇的浓度。
五、实验结果1、标准曲线记录各标准管的胆固醇浓度和对应的吸光度值，绘制标准曲线。
标准曲线应呈线性关系，相关系数（r）应大于 098。
血清胆固醇的测定
余留海
2013.11.26
血清胆固醇的测定（氧化酶法）
Assays for Serum Cholesterol
一、原理 二、测定方法 三、参考值 四、临床意义 五、方法学评价 六、注意事项 七、小结
一、原理
血清中总胆固醇（TC）包括游离胆固 醇（FC）和胆固醇酯（CE）两部分。血清 中胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆 固醇和游离脂肪酸（FFA），胆固醇在胆固 醇氧化酶的氧化作用下生成胆甾烯酮和过 氧化氢，过氧化氢在4-氨基安替比林和酚 存在时，经过氧化物酶催化，反应生成苯 醌亚胺非那腙的红色醌类化合物。
血清总胆固醇水平分为三级：合适范围 5.72mmol/L(220mg/dl)。边缘升高5.235.69mmol/L(201-219mg/dl)；过高值 >5.72mmol/L(220mg/dl)。 血清总胆固醇水平增高是导致冠心病的独立 危险因素。血清总胆固醇越高，发生动脉粥样硬 化的风险越大，时间也越早。血清总胆固醇每降 低1%，发生冠心病的危险性可减少2%。但另一 方面，血清总胆固醇降到多低合适？目前认为， 将 血清总胆固醇保持在2.1-5.2mmol/L(90200mg/dl)范围内较为合适。对已有动脉粥样硬 化或冠心病者，应将胆固醇降至180mg/dl以下。
五、方法学评价
1. 线性范围： 0.05～12.9mmol/L，r≥0.990 2. 精密度：CV ≤3.0%，批间差≤5.0%， 3. 准确度：相对偏差 ±10% 4. 试剂空白吸光度≤0.150（波长505nm，光径 10mm） 5. 左旋多巴、尿酸、vitc、胆红素、谷胱甘肽等 达一定浓度时可竞争过氧化氢使结果偏低 6. 半胱氨酸（促G生成）使结果偏高。
各管充分混匀置37水浴10分钟后， 室温冷却测定
使用胆固醇实验报告
一、实验目的1. 了解血清总胆固醇测定的原理和方法。
2. 掌握血清总胆固醇测定的操作步骤。
3. 通过实验，了解血清总胆固醇在临床诊断中的重要性。
二、实验原理血清总胆固醇（Total Cholesterol，TC）是血液中所有胆固醇的总和，包括游离胆固醇和胆固醇酯。
血清总胆固醇的测定对于了解人体脂代谢状况、预防心血管疾病具有重要意义。
胆固醇氧化酶法是常用的测定方法，其原理如下：1. 在反应液中，胆固醇与胆固醇氧化酶（Cholesterol Oxidase，COX）和辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）反应，生成胆汁酸和过氧化氢。
2. 过氧化氢在过氧化物酶的作用下，将邻苯二胺（O-Phthaldialdehyde，OPA）氧化为邻苯二醌，产生蓝色。
3. 通过测定蓝色物质的吸光度，可以计算出血清中的总胆固醇含量。
三、实验材料1. 试剂：胆固醇氧化酶试剂、邻苯二胺试剂、硫酸铵、盐酸、磷酸盐缓冲液、血清样本等。
2. 仪器：紫外-可见分光光度计、离心机、移液器、试管等。
四、实验步骤1. 样本处理：将血清样本离心，取上清液待测。
2. 混合试剂：按照试剂说明书，将胆固醇氧化酶试剂、邻苯二胺试剂、硫酸铵、盐酸、磷酸盐缓冲液等混合均匀。
3. 测定吸光度：将混合好的试剂加入待测血清样本，用紫外-可见分光光度计在特定波长下测定吸光度。
4. 计算结果：根据标准曲线，计算血清总胆固醇含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：取一系列已知浓度的胆固醇标准溶液，按照实验步骤进行测定，绘制标准曲线。
2. 样本测定：将待测血清样本按照实验步骤进行测定，得到吸光度值。
3. 结果计算：根据标准曲线，计算血清总胆固醇含量。
六、实验讨论1. 本实验采用胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇，操作简便，结果准确。
2. 实验过程中，应严格控制反应时间、温度等条件，以保证实验结果的准确性。
3. 血清总胆固醇的测定在临床诊断中具有重要意义，有助于了解人体脂代谢状况、预防心血管疾病。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
生物化学与分子生物学设计实验
（胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一肟
法测定血清尿素）
小组成员：
班级：麻醉11-2班
日期：2012年12月19
胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一肟法
测定血清尿素
实验目的
1、掌握酶法测定总胆固醇的原理和方法。
2、学习用比色法测定血清尿素。
3、巩固有关胆固醇和尿素的知识。
4、进一步熟练UV2100型分光光度计的
重点、难点：
重点：1、氧化酶法测定总胆固醇的原理
2、二乙酰一肟法测定血清尿素的注意事项
难点：氧化酶法测定总胆固醇的原理
一、实验原理
（一）氧化酶法测定血清总胆固醇
血清总胆固醇(TC)包括：游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)两部分。
本实验是胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶相偶联发生的偶联反应。
第一步：血清胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸(FFA) 。
第二步：胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成△4-胆甾烯酮和H
2O
2。
第三步：H
2O
2
在4-氨基安替比林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生
成苯醌亚胺非那腙的红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中TC含
量成正比。
（二）二乙酰一肟法测定血清尿素
二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。
因二乙酰不稳定，故由试剂中二乙酰一肟与强酸作用产生二乙酰。
二、操作步骤
（一）氧化酶法测定血清总胆固醇
终点法检测TC，取试管3支按下表依次加样。
酶法测定TC操作步骤
加入物(μl)空白管标准管测定管血清－－20
标准液或定值血清－20－蒸馏水20－－
酶试剂 1 000 1 000 1 000
混匀后，37℃保温10 min，每管加3ml水混匀，用分光光度计比色，于500 nm波长处以空白管调零，读出各管吸光度。
（二）二乙酰一肟法测定血清尿素
取试管3支，按下表依次加样。
二乙酰一肟法操作步骤
加入物(ml)空白管标准管测定管
血清－－0.02
尿素标准应用液－0.02－
蒸馏水0.02－－
二乙酰一肟溶液0.50.50.5
酸性试剂 5.0 5.0 5.0混匀，置沸水浴加热12min，取出置冷水中冷却5min，以空白管调零，在540nm处读取各管吸光度。
三、注意事项
（一）氧化酶法测定血清总胆固醇
1、最后加酶试剂，各管反应时间应一致；
2、比色应在30min内完成；
3、试管在操作前尽量保持干燥；
4、试剂中酶的质量影响测定结果；
5、若需检测游离胆固醇浓度，将酶试剂成分中去掉胆固醇酯酶即可。
（二）二乙酰一肟法测定血清尿素
1、试剂中加入氨基硫脲和镉离子，可增进显色强度和色泽稳定性，但仍有轻度
褪色现象，(每小时小于5%)。
煮沸显色经冷却后，应及时比色。
2、尿液中尿素也可用此法测定，但因浓度高，需先用去离子水作50倍以上稀释。
3、注意洁净干燥，加量务必准确。
4、水浴时注意打开水浴箱盖，以免水汽入管。
5、酸性试剂中酸的含量较浓，要小心使用。
四、思考题
1. 血清胆固醇浓度升高或降低有何临床意义？
2. 血清尿素浓度升高或降低有何临床意义？
3. 血清非蛋白氮(NPN)与尿素的区别，它包括哪些？
小结
氧化酶法测定血清总胆固醇，此方法特异性好和灵敏度高，既可用于手工操作，也可自动化分析；既可作终点法检测，也可作速率法检测。
在终点法中血红蛋白高于2g/L时引起正干扰；胆红素高于0.1g/L时有明显负干扰；血中维生素C与甲基多巴浓度高于治疗水平时，会使结果降低。
但是在速率法中上述干扰物质影响较小。
高TG血症对本法无明显影响。
检测TC的血清(浆)标本密闭保存时，在4℃可稳定1周，－20℃可稳定半年以上。
二乙酰一肟法测定血清尿素，试剂单一，方法简便，但试剂具毒性和腐蚀性。
在标本数量多时加热开始难以达到100℃，各管间受热温度也可能不一致，因而本法重复性不佳。
若改善加热条件，如采用在水浴锅底部加置高约5mm的网垫，在网垫上加热显色，可使CV由不加网垫时的6.46%降至2.99%。
线性上限仅达7.14mmol/L；回收率为96%～102.1%。
二乙酰一肟法的主要干扰来自血清中存在的含氮化合物。
很多其它化合物在结构中会有尿素的残基，如瓜氨酸、四氧嘧啶和尿囊素，虽然也会产生一种带颜色的产物，但这些化合物在血清中浓度很低，故很少引起明显的干扰。
另一些其它的化合物在血清中浓度高，但这些色素的最大吸收峰不同，因此不产生明显干扰。
胆红素达171
μmol/L、血红蛋白达10g/L均无影响。
（注：可编辑下载，若有不当之处，请指正，谢谢!）。