核酸分离和纯化

异丙醇
优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的 DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。
缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥
发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
聚乙二醇（PEG）Hale Waihona Puke Baidu
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈
现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物， 例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提 实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。
(2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操
作时应戴手套。
2.3 沉淀核酸
重新调整核酸的浓度，起到浓缩核酸的作用； 去除溶液中某些盐离子与杂质； 改变核酸的溶解缓冲液。
(2) 核酸纯度的要求：
① 非核酸生物大分子的污染降低到最低程 度，如蛋白质、多糖和脂类分子；
② 排除其它核酸分子的污染，如制备RNA 时，DNA分子是污染物；
③ 去除对后续实验有影响的物质，如有机 溶剂和过高浓度的金属离子。
2. 核酸制备的基本步骤
I.材料准备
破碎细胞
II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，纯化并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
2.1 破碎细胞
(1)玻璃匀浆器匀浆
(2)液氮研磨法
富含DNA酶的胰、脾、胸腺、淋巴； 富含胶原蛋白的皮肤、肌腱； 坚硬的组织如骨骼。
(3)高速组织捣碎机捣碎 (4)超声波处理法
(5)化学处理法(SDS、吐温80等） (6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等）
PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L 的MgCl2。
精胺
精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。
原理是： 精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩
而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质 与DNA分开，达到纯化DNA的目的。
2.3.2 核酸沉淀的温度和时间
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。 但时间过长，易导致盐与DNA共沉淀，影响以 后的实验。一般使用0℃冰水，10-15min， DNA样品足可达到实验要求。
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使 氢键破坏，核蛋白解聚；
（3）酚/氯仿抽提
酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑 制作用。
氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中 的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。
在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使 水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异 戊醇=25：24：1）。
3. 核酸的浓度和纯度的测定
3.1 紫外分光光度法鉴定核酸 3.2 荧光光度法鉴定核酸
3.1 紫外分光光度法鉴定核酸
3.1.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量
盐 贮存液浓度（mol/L) 终浓度(mol/L)
MgCl2
1
0.01
NaAc
3 (pH5.2)
0.3
KAc
3 (pH5.2)
0.3
NH4Ac
10
2.5
NaCl
5
0.2
LiCl
8
0.8
② 常用的有机沉淀剂
乙醇
优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除 去，不影响以后实验。
缺点： 需要量大，一般要求低温操作。
核酸的分离和纯化
找答案？
➢ 核酸分离纯化的原则是什么？为防止 核酸降解需要注意什么？
➢ 核酸制备基本步骤？ ➢ 如何鉴定核酸浓度和纯度？ ➢ 核酸的保存方法有哪些？
前言
核酸（nucleic acid）是以核苷酸为基本组成单位 的生物信息大分子。是遗传信息的携带者，是基 因表达的物质基础。
核酸的分类：
DNA纯化柱
核酸提取（离心柱型） 利用硅胶膜特异吸附核酸
2.3.1 核酸的有机溶液沉淀法
当核酸溶液的pH值 大于4时，核酸分子呈 多聚阴离子状态。
钾、钠、镁、锂及铵 根等阳离子形成的盐， 通过屏蔽带负电的磷酸 基团使DNA分子聚结在 一起而不溶于许多有机 溶剂。
Na+ Mg2+ Li+
① 核酸沉淀的盐类及浓度
RNA酶分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、 耐酸碱、不易失活，生物降解是RNA提取过程中 的主要危害因素。0.1%DEPC浸泡，器械180℃ 干烤8h。
④ 减少物理因素对核酸的降解，主要 是机械剪切力，其次是高温。
机械剪切力包括强力高速的振荡、突然暴 露于低渗液、样品反复冻融等。
高温，如长时间的煮沸。
① 尽量简化步骤，缩短提取时间，减少各种 有害因素对核酸的破坏。
② 减少化学因素对核酸的降解，pH4-10。
③ 防止核酸的生物降解（细胞内或外的 各种核酸酶水解）。
④
所用器械和一些试剂需高压灭菌，提取缓
冲液中需加核酸酶抑制剂。操作温度为0~4℃。
DNA酶需要金属离子Mg2+、Ca2+的激活，因此 使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等； 阴离子表面活性剂SDS。
1. 核酸分离与纯化的原则及要求
1.1 核酸分离与纯化的一般原则
(1) 保持核酸分子一级结构的完整性，是核酸结 构和功能研究的最基本要求。
(2) 排除其他分子的污染，保证核酸的纯度。
1.2 核酸分离与纯化的要求
(1) 为保证核酸的完整性，
化学因素？ 生物因素？ 物理因素？
（防止降解），在实验中应注意：
2.2 核酸分离，去除蛋白
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核 酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。
分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白 质分开，同时避免核酸降解。
（1）加入SDS
SDS除有破膜和抑制核酸酶的作用外，还具有 使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
（2） 加入浓盐溶液（如NaCl）
DNA 核内染色体 DNA。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA，叶绿体 DNA。 质粒DNA。
RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病 毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。
主要内容
1. 核酸分离与纯化的原则及要求 2. 核酸制备的基本步骤 3. 核酸的鉴定和保存 4. 核酸提取方法简介