小鼠pcr基因扩增及鼠灌注取脑操作

小鼠PCR基因鉴定
一、取材：小鼠出生后3-4周，给小鼠打耳标，并依照雌雄分笼饲养，
需要鉴定的小鼠剪尾部、脚趾或耳部边缘，放置好在印管中，并做好相应的标志，放置标本与标志混乱。

处理: (1)将A液一定量加入带有样本的印管中，在98℃孔板中煮1小时
（2）取出印管后，再加入B液75 μl
二、扩增
1.反应体系 Mix 5μl
H20 3μl
Primer1 0.5ml
Primer2 0.5ml
2.加样
先计算出所需总量，加入印管中，混合均匀，离心，摆放好单个PCR管，将上述混合液放入PCR仪，每管9 μl盖紧。

3.扩增
打开PCR仪并设置好程序，将PCR管放入PCR仪，扩增，40多分钟可以完成。

4.保存
扩增后，取出PCR管，放入冰中保存。

三、琼脂糖凝胶电泳
1.制胶：电子天平称取计算后的琼脂糖，小心倒入干净的锥形瓶内（锥
形瓶内保持干净）。

加入TAE缓冲液，盖上锡箔纸，加热。

取制胶模具、梳子，安装固定，保证不会漏胶。

戴上手套，取出锥形瓶，掀开锡箔纸，冷却3-4分钟，加入染色剂，贴着远梳子端的制胶模板壁缓慢倒入琼脂糖溶液，若有气泡。

室温放置凝固。

2.上样：胶凝固后，双手缓慢垂直地拔出梳子，避免破坏梳孔。

将胶
板放上电泳槽，注意正负极变化，加入1×TAE缓冲液，从胶表面开始缓慢倒入，自然流向两边，然后依次对孔加入对应的DNA样品，剩余样品放入冰箱储存。

3.电泳：合上电泳槽，正负极对好，检查底部是否有气泡升起。

有气
泡则电泳开始。

4.成像：观察是否出现条带，若出现条带，则停止电泳，打开凝胶成
像系统，对结果进行比对、记录并拍照。

关闭系统，登记实验记录，取出胶并清洗仪器器材。

鼠灌注取脑
1、麻醉：根据鼠的体型、重量适量注射麻醉剂，腹腔注射，用手套防止被鼠抓伤，虎口卡住颈部肌肉及其周围肌肉，注射药物时反推针筒活塞以防有空气，针头针刺入鼠腹腔注射药物后，并放回笼中，等待药物起效。

2、开胸：找到剑突，用弯剪在剑突附近把毛剪干净，露出表层皮肤，再沿肋弓朝两边剪开，注意深度，别剪到心脏，待心脏暴露出后，仔细剔除神经，剪掉心包膜，用镊子夹持剑突并将其连胸廓上翻固定，使心脏充分暴露。

3、穿刺：用镊子轻轻夹住心室（心尖处），但不要夹的过紧，要让心脏内留有一定的间隙。

用小剪刀在心尖处先剪开一个一个小口，再插入灌注针。

再将灌注针卡死在镊子（右心耳在灌注针插入后用小剪刀剪开）
4、灌注：0.9%Nacl 200ml，然后再注射2管多聚（先快后慢）成功标志：（1）生理盐水：在右心耳流出液体血色较浅基本澄清，眼珠、肝脏变白——排出血液成功。

（2）多聚甲醛：使鼠四肢僵硬。

5、取脑：（1）枕骨大孔用剪刀剪断，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀剪开顶骨，注意不要损伤脑组织。

（2）用镊子小心掰断两边顶骨。

（3）用剪刀于一侧剪断附近骨组织。

（4）取出后脑存放于PBS中，隔24h先后更换15%和30%蔗糖溶液。