第十五章分枝杆菌属
微生物检验学之分枝杆菌属及检验
分枝杆菌属及检验分枝杆菌属是一类细长或略带弯曲、为数众多（包括54个种）呈分支状生长的需氧杆菌。
因其繁殖时呈分支状生长故称分枝杆菌。
本属细菌的主要特点是细胞壁含有大量脂类，可占其干重的60%，这与其染色性、抵抗力、致病性等密切相关。
耐受酸和抗乙醇，一般不易着色，若经加温或延长染色时间而着色后，能抵抗3%盐酸乙醇的脱色作用，故又称抗酸杆菌。
需氧生长，无鞭毛，无芽胞和荚膜。
引起的疾病均为慢性，有肉芽肿病变的炎症特点。
分枝杆菌的种类较多，包括结核分枝杆菌、非典型分枝杆菌和麻风分枝杆菌。
非典型分枝杆菌是一大群分枝杆菌的总称，与人类有关的非典型分枝杆菌主要有堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈分枝杆菌、鸟分枝杆菌、蟾分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌和耻垢分枝杆菌等。
本属细菌无内外毒素，其致病性与菌体某些成分如索状因子、蜡质D及分枝菌酸有关。
根据国际分枝杆菌分类研究组（IWGMT）的方案将本属细菌分为三类，即缓慢生长菌、迅速生长菌和不能培养菌。
一、结核分枝杆菌在我国引起人类结核病的主要有人型和牛型结核分枝杆菌。
（一）生物学特性1.形态与染色结核分枝杆菌为细长或略带弯曲的杆菌。
在培养基中可呈球状或丝状，陈旧培养物或干酪化的淋巴结中可见到分枝状。
抗酸染色时因菌体含有大量脂类而不易着色，无论是否经碘液处理，着色后均不易被盐酸乙醇脱色，所以使菌体呈红色。
本菌无芽胞、无鞭毛，近年发现有荚膜。
2.培养特性本菌专性需氧，在无氧条件下迅速死亡，在5%～10%CO2环境中可刺激其生长。
烛缸不适合本菌培养，需用二氧化碳培养箱。
培养温度适应范围较大，35～40℃均可生长，最适温度为35～37℃。
最适pH为6.5～6.8。
兼性胞内寄生菌，在细胞内外均可发育繁殖，强毒株可长期生存于巨噬细胞内。
生长时还需适当的湿度。
本菌生长缓慢，最快的分裂速度为18小时一代。
在固体培养基上，一般需2～6周才能长出菌落。
菌落呈干燥颗粒状，不透明，乳白色或米黄色，表面呈皱纹状，形似菜花。
分枝杆菌属ppt演示课件
概念：一类细长弯曲的杆菌，因有分枝生长的趋势而命名 特点 • 细长弯曲，分枝状生长 • 无鞭毛、荚膜和芽胞 • 需氧菌，培养要求较高，多数生长缓慢 • 革兰染色不易着色，抗酸染色阳性
分类 • 结核分枝杆菌群 • 麻风分枝杆菌
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结核分枝杆菌简称结核杆菌，是引起结核病 的病原菌，对人致病的主要是结核分枝杆 菌（人型），其次是牛分枝杆菌（牛型）。 • 全球总疫情 20亿人口感染了结核菌，现症结核病 人2000万，每年新发病人数800－1000 万，每年300万人死于结核病。 • 我国疫情 现有活动性肺结核病人500万人，传染 性肺结核病人200万人，每年因结核病 死亡13万人。
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PPD试验强阳性
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（2）意义
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阳性： 过去/BCG成功，有免疫力 强阳性：现在 活动性 阴性： 无/未接种BCG 假阴性： 感染初期，老年人，严重结核合并其它传染病 使用免疫抑制剂 艾滋病等免疫功能低下者
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治疗
治疗原则是早期、联合、规范、足量、 全程用药，尤其以联合和规范用药为重要， 有协同作用，且能降低耐药性的产生。常 用药物有异烟肼、利福平、链霉素、对氨 基水杨酸、乙胺丁醇等。
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二、麻风分枝杆菌
麻风分枝杆菌俗称麻风杆菌，人 是它的唯一宿主，引起麻风病，1874年 由挪威医生汉森发现。
【生物学特性】 麻风杆菌的形 态、染色性与结核 分枝杆菌相似。体 外人工培养尚未成 功。对干燥、低温 有抵抗力，对紫外 线及湿热敏感。
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【 致病性 】
麻风病是一种慢性传染病，世界各地均有流 行，主要分布于亚洲、非洲、拉丁美洲。解放后 我国对麻风病采取了积极的防治措施，目前发病 率已很低。
第15章分枝杆菌
第15章分枝杆菌表15-1 分枝杆菌的分类分类生长速度菌落和色素产生代表菌种致病性结核分枝杆菌复合群生长缓慢结核分枝杆菌、牛分枝杆菌结核病非结核分枝杆菌RunyonⅠ组生长缓慢菌落不见光时为淡黄色,光照后则变为黄色或橙色堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、海分枝杆菌(M. marinum ) 肺结核样病变；皮肤丘疹、结节与溃疡RunyonⅡ组在37℃生长缓慢在暗处培养时菌落呈橘红色瘰疠分枝杆菌(M. scrofulaceum)儿童淋巴结炎RunyonⅢ组40～42℃下生长慢通常不产生色素鸟-胞内分枝杆菌(M.avium)结核样病变，多见于肺与肾RunyonⅣ组在25～45℃快速生长。
培养5～7天即可见到菌落个别种产生色素偶发分枝杆菌(M.fortuitum)极少致病麻风分枝杆菌人工培养基上不生长麻风第一节结核分枝杆菌俗称结核杆菌，是结核病的病原菌。
该菌可侵1/3感染了结核分枝杆菌。
特别是近年来世界范围内艾滋病的流行，结核病作为最多见的一种机会性感染，成为HIV阳性者死亡的主要原因，因此，结核病已成为全球重大公共卫生问题。
一、生物学性状（一）形态与染色在感染的组织中，结核分枝杆菌细长且直，大小约0.4×3 m（图15-1）；在人工培养基上，不同种呈现丝状、球状、串珠状等多形性。
由于结核分枝杆菌细胞壁中含有大量的脂质，不易着色，一旦被碱性染料着色后能够抵抗盐酸乙醇（含95%的乙醇和3%的盐酸）的脱色作用，被定性为抗酸菌（acid-fast bacteria），一般不用革兰染色法分类为革兰阳性或革兰阴性。
常用齐尼抗酸染色法（Ziehl-Neelsen acid-fast stain），以5%石碳酸复红加温染色后再经3%盐酸乙醇脱色，结核分枝杆菌被染成红色，而其他非抗酸菌及背景则被美蓝复染呈蓝色。
此外，结核分枝杆菌在药物如异烟肼的影响下，亦可变为抗酸染色阴性。
图15-1 痰标本中的结核分枝杆菌（箭头所指）（Brooks et al, 2004）（二）培养和生长特性结核分枝杆菌的初代分离培养应使用选择和非选择培养基。
第15章 分枝杆菌属
第二节
非结核分枝杆菌
(nontuberculosis mycobacteria)
概念
结核分枝杆菌、牛分枝杆菌与麻风分枝杆菌以外的 分枝杆菌
鉴别
• • • • • • 对酸、碱比较敏感 对常用的抗结核菌药物较耐受 生长温度不如结核分枝杆菌严格 多存在于环境中 为条件致病菌 可引起结核样病变而受到关注 抗原与结核分枝杆菌有交叉
第15章 分枝杆菌属
(Mycobacterium)
特点
◆胞壁中含有大量脂质，抗酸染色，故又称
抗酸杆菌(acid-fast bacilli)
◆无鞭毛、荚膜、芽胞，不产生毒素
◆种类多，生长大多缓慢，致病多为慢性
分枝杆菌的分类
分类 结核分枝杆菌复合群 非结核分枝杆菌 Ⅰ组 Ⅱ组 Ⅲ组 Ⅳ组 麻风分枝杆菌 生长特性 生长缓慢 生长缓慢、光产色 生长缓慢、暗产色 生长缓慢、不产色 生长快速、 人工培养基上不生长 主要对人致病的分枝杆菌 结核分枝杆菌、牛分枝杆菌 堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌 瘰疠分枝杆菌 鸟-胞内分枝杆菌 偶发分枝杆菌
试验方法与结果
• OT或PPD 于两前臂皮内注射 • 48 ～ 72h 后红肿硬结超过 5mm 者为阳性≥ 15mm 为强阳性，
阴性反应
解释
应用
• 选择卡介苗接种对象和测定卡介苗接种后的免疫效果。 结核菌素试验阴性者应接种或补种卡介苗 • 在未接种卡介苗的人群中作结核杆菌感染的流行病学 调查,了解人群自然感染率
引起超敏反应 使中性粒细胞增多，引起局部灶细胞浸润 刺激机体产生特异性细胞免疫
•
感染方式 – 呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入机体
常见的感染部位 木乃伊存活的结核杆 菌DNA显微照片。
所致疾病
(医学微生物学)15 分枝杆菌
荚膜
(capsule)
有助于粘附、 入侵、抗吞噬 等
致病性与免疫性
致病物质
类脂（lipid) ： 60%
分枝菌酸(mycolic acid) 索状因子(cord factor) 蜡质D(wax-D) 磷脂(phosphatide) 硫酸脑苷酯(sulfatide)
蛋白质(proteins)：
和蜡质D结合后能使机体发生超敏反 应，引起组织坏死和全身中毒症状， 并在结核结节的形成中起一定的作用
生物学性状
专性需氧 营养要求高 分离培养用罗氏培养基 （Lowenstein-Jensen） 代时约18h 3~4周形成“菜花样”菌落
抵抗力
抗干燥：在干燥痰中可存活6~8个月，附着在空 气的尘埃中传染性可保持8~10天
抗酸碱：用酸碱处理标本，杀死杂菌和消化标 本中的粘稠物质，提高检测效果
抗染料：在培养基中加入孔雀绿可抑制杂菌生长
TB X-ray photo
结核的X光片及病理
Tuberculosis – hematogenous extension
Extrapulmonary
Lymph nodes
Liver
Bones
免疫性
1、免疫性：胞内感染，细胞免疫为主，体液免疫效果差 2、感染免疫(infection immunity)：有菌免疫 3、结核菌素试验（ tuberculin skin test ）
对酒精、湿热及紫外线抵抗力较弱
Koch (1843-1910) isolated the strain in 1882
Calmette (1863-1933) and Guerin (1871-1961) studied the vaccine
The first clinical trial in 1921
15第十五章 分枝杆菌属检验
第十五章分枝杆菌属检验一、名词解释1.卡介苗（BCG）2.抗酸杆菌(acid-fast bacilli)3.结核菌素试验4.旧结核菌素(OT)5.索状因子二、选择题【A1型题】1.下列细菌中繁殖最慢的是A、大肠埃希菌B、丙型链球菌C、脑膜炎奈瑟菌D、结核分枝杆菌E、肺炎链球菌2.在液体培养基中形成菌膜生长的细菌是A、变形杆菌;B、布氏杆菌;C、肉毒梭菌;D、结核杆菌;E、产气荚膜杆菌3.结核分枝杆菌常用的培养基是A、沙保培养基B、罗氏培养基C、疱肉培养基D、巧克力色培养基E、亚碲酸钾培养基4.细胞壁含脂类最多的细菌是A、结核杆菌B、白喉棒状杆菌C、衣氏放线菌D、霍乱弧菌E、幽门螺杆菌5.与结核分枝杆菌抗酸性有关的成分是A、索状因子B、磷脂C、分枝菌酸D、蜡脂DE、硫酸脑苷脂6.关于结核分枝杆菌侵入机体的途径 ,不可能的是A、呼吸道B、消化道C、破损的皮肤D、泌尿道E、节肢动物的叮咬7.不以内毒素或外毒素为致病物质的细菌是A、白喉棒状杆菌B、炭疽芽胞杆菌C、结核分枝杆菌D、铜绿假单胞菌E、布鲁菌8.人体对结核分枝杆菌的免疫特点是A、体液免疫和细胞免疫同时存在B、以体液免疫为主C、有菌免疫D、不能通过人工主动免疫获得E、可引起I型超敏反应9.卡介苗是A、经甲醛处理后的人型结核分枝杆菌B、加热处理后的人型结核分枝杆菌C、发生了抗原变异的牛型结核分枝杆菌D、保持免疫原性 ,减毒的活的牛型结核分枝杆菌E、保持免疫原性 ,减毒的活的人型结核分枝杆菌10.卡介苗的接种对象主要是A、结核性脑膜炎患者B、结核菌素试验阳性者C、严重结核病人 , 结核菌素试验阴性患者D、新生儿和结核菌素试验阴性的儿童E、老年人11.有关结核菌素试验 ,下述错误的是A、属于皮肤迟发型超敏反应B、可检测机体对结核杆菌的免疫状况C、皮肤反应程度以局部红肿，硬结的直径为标准D、可检测机体细胞免疫功能E、12～18小时观察结果12. 结核菌素试验为阳性反应 ,下述叙述可能错误的是A、表明机体已感染过结核杆菌;B、表明机体接种卡介苗成功;C、表明机体对结核杆菌有一定的特异性免疫;D、表明机体对结核杆菌有迟发型超敏反应;E、表明机体对结核杆菌无免疫力13. 从痰中检出具有临床诊断意义的细菌是A、表皮葡萄球菌B、金黄色葡萄球菌C、甲型溶血型链球菌D、脑膜炎奈瑟菌E、结核分枝杆菌14.下列各细菌细胞壁中含脂量最多的是A、结核杆菌B、白喉杆菌C、放线菌D、霍乱弧菌E、幽门螺杆菌15.关于结合分枝杆菌生物学特性的叙述，错误的是A、专性需氧B、抗酸染色呈红色C、菌落表面粗糙呈菜花状D、耐酸碱E、耐煮沸，100℃，15分钟才死亡16.下列各成分与结核杆菌的致病性有关 ,除外的是A、结核杆菌索状因子B、磷脂C、结核杆菌内毒素D、蜡脂DE、硫酸脑苷脂17.关于结核菌素试验,下列错误的是A、可用来选择卡介苗接种对象B、检测机体细胞免疫和体液免疫状况C、作为婴幼儿结核病的辅助诊断D、红肿硬结直径大于0.5cm为阳性E、试验阳性说明已感染过结核杆菌18.下列最适合接种卡介苗的对象是A、长期低热和咳嗽，疑为肺结核的患儿B、OT试验阴性的麻疹患儿C、OT试验阳性儿童D、OT试验阴性儿童E、OT试验阴性的细胞免疫缺陷者19.一位18岁女学生就诊时主诉：近一个月来咳嗽，痰中时有血丝。
分枝杆菌属PPT课件
结果： 菌体成分消失，免疫力消失.
侵犯部位：皮肤黏膜、周围神经及内脏
A,plasma membrane.
红肿硬结≥5mm，阳性（ 形态变异：在抗结核药作用下形成L型
免疫状态：细胞免疫接近正常
≥
15mm，强阳性）
红肿硬结＜5mm，阴性 （2）磷脂: 刺激单核细胞增生，病灶形成结核结节，及干酪样坏死等。
结局 （但病灶内常有细菌的潜伏）
机体抵抗力差: 活动性肺结核
（2）继发感染——常见成人（机体抵抗力弱时， 原发病灶引起的内源性感染，或菌再次入侵）
特点：局部病变重，但不易扩散，易发生干 酪样坏死，可形成空洞和开放性肺结核
肺外感染: 结核杆菌经血液，淋巴液扩散 肠结核、结核性脑膜炎、皮肤结核、肾结
培养特性
专性需氧，温度37℃，pH6.4-7.0
营养要求高，罗氏培养基（蛋黄、甘油、天门 冬素、马铃薯、无机盐、孔雀绿等）
生长缓慢，18h分裂一次，2-4W形成R型菌落， 乳白色、干燥不透明、表面粗糙呈颗粒、结节、 边缘不整。
抵抗力强
抗干燥(干痰中存活6-8个月)，抗酸碱，抗染料。 对酒精、湿热和紫外线敏感
核、骨结核等。
免疫力
主要是细胞免疫：对该菌的免疫力随结核杆 菌或其成分在体内存在而存在，故称感染免 疫或有菌免疫. 菌体成分消失，免疫力消失.
结核菌素试验
原理：用结核菌素进行皮肤试验来测定机体对结核杆 菌能否有超敏反应，以判断机体有无免疫力.
试剂: 纯蛋白衍生物（PPD）5U
条件致方病菌，法发生：于机前体抵抗臂力下内降 侧皮内注射，48-72h观察
肺部感染
免疫状态：细胞免疫接近正常
（1）原发感染(初次感染，形成病灶) （防但治病灶内常有细菌的潜伏）
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第十五章分枝杆菌属
教学要求
1．掌握结核分枝杆菌的生物学性状、免疫特点、结核菌素试验和卡介苗预防。
2．熟悉结核分枝杆菌的致病和免疫机制、微生物学检查法、抗酸染色的原理、步骤及结果。
3．了解分枝杆菌属的通性和种类、非结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌的特性及致病性。
教学要点
[学习引导]
1．简述结核分枝杆菌形态染色，生长，抵抗力特点及与脂质之间的关系。
2．何谓抗酸染色？BCG来源及应用
3．简述结核菌素试验的原理，结果，解释和用处。
4．简述结核分枝杆菌的免疫特点，BCG来源及应用。
分枝杆菌属是一类细长略弯曲的杆菌，因繁殖时有分枝生长的趋势而得名，一般不易着色，但加温或延长染色时间着色后能抵抗盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌，致病菌主要有结核分枝杆菌，引起结核病；麻风分枝杆菌，引起麻风病；还有其他非典型分枝杆菌经常感染艾滋病人，是免疫抑制病人的机会致病菌。
一、结核分枝杆菌(M. Tuberculosis)
（一）生物学特性
1．形态染色结核分枝杆菌细长且直，不同种可呈现丝状、球状、串珠状等多形性。
抗酸染色法是以5%石碳酸复红加温染色后再经3%盐酸乙醇脱色，再以美蓝复染，结核分枝杆菌能抵抗酸酒精脱色，被染成红色，为抗酸染色阳性。
2．培养培养特点为专性需氧、营养要求高、生长缓慢，常用罗氏固体培养基，在固体培养基上培养2~4周后，形成菜花样R型菌落，液体培养基上呈表面生长，形成菌膜3．抵抗力因细胞壁中含大量脂质，故抵抗力较强且与一般细菌不同，对干燥、酸碱和碱性染料抵抗力强(三强)；而对乙醇、湿热及紫外线抵抗力较弱，抗结核药异烟肼、链霉素、利福平等有效（四不强）。
4．变异性结核分枝杆菌的形态、菌落、毒力及耐药性等均可发生变异
（1）耐药性变异：结核分枝杆菌对抗结核药物较易产生耐药性，造成耐药菌株增多，给治疗造成困难
（2）毒力变异：将有毒的牛分枝杆菌培养于含甘油、胆汁、马铃薯的培养基中，经230次移种传代，历时13年而获得了减毒活菌株，即卡介苗，目前广泛用于人类结核病的预防（二）致病性
1．致病物质及其致病机制
（1）脂质：成份复杂，与毒力有关的成分有：
1）索状因子：破坏细胞线粒体膜、影响细胞呼吸、抑制白细胞游走和引起慢性肉芽肿。
2）磷脂：使炎症灶中的巨噬细胞转变为类上皮细胞，从而形成结核结节。
3）硫酸脑苷脂：抗吞噬作用。
4）蜡质D：可激发机体产生迟发型超敏反应。
（2）蛋白质：有抗原性，和蜡质D结合后能使机体发生超敏反应，
（3）多糖：细胞壁表面的多糖物质类似荚膜，能够抵抗吞噬细胞的吞噬作用。
2．所致疾病
（1）传播途径及所致疾病：结核分枝杆菌可经呼吸道、消化道、破损的皮肤粘膜等多
种途径进入机体，侵犯多种组织器官，引起相应的结核病，但易通过吸入含菌的飞沫微粒或尘埃进入肺泡，故结核病以肺部感染最多见
（2）疾病类型
1）肺部感染：可分原发感染和原发后感染两大类，
原发感染：初次感染而在肺内发生的病变，多发生于儿童，主要特点为人体缺乏对结核分枝杆菌的特异性免疫力，病灶局部反应轻微，但原发灶内的结核分枝杆菌易扩散。
原发灶、淋巴管炎和肿大的肺门淋巴结合称为原发综合征。
原发后感染：多为原发感染的再活化，也可由外源性再感染引起，发生于成年人，病灶以肺部为多见，主要特点为机体已有了对结核分枝杆菌的特异性免疫力，因此，病灶多局限，一般不累及邻近淋巴结。
呈慢性组织损害，易发生结核结节、干酪样坏死和纤维化。
当病灶中大量结核分枝杆菌释放至痰中，称为开放性肺结核。
部分患者结核分枝杆菌可进入血液循环引起肺内播散，形成血行播散型肺结核
2）肺外感染：当结核分枝杆菌进入血液循环引起肺外播散时，可致肺外结核病，如脑、肾、骨、关节、肠、生殖系统等结核。
（三）免疫性
1．特点以细胞免疫为主，属有菌免疫(感染免疫)；感染、免疫与超敏反应同时存在2．OT试验
（1）原理：应用结核菌素（目前采用结核杆菌制成的纯蛋白衍化物）进行皮肤试验来测定机体对结核分枝杆菌是否能引起超敏反应的一种试验，以判断机体对结核分枝杆菌有无免疫力。
（2）方法：取纯蛋白衍化物5单位分别注射于两前臂皮内，48～72小时后观察结果。
（3）结果判断：红肿硬结小于5mm者为阴性，超过5mm者为阳性，超过15mm为强阳性，阴性为无免疫力；阳性为有免疫力。
（4）应用：可用于①选择卡介苗接种对象及接种效果测定；②作为婴幼儿结核病诊断的参考；③借用其测定肿瘤患者细胞免疫功能；④在未接种过BCG的人群中作结核杆菌感染的流行病学调查。
（四）微生物学检查：
1．形态学检查标本直接涂片或集菌后涂片，进行Ziehl-Neelsen抗酸染色。
若找到抗酸阳性菌即可初步诊断，特别是痰液等标本，更有诊断意义。
2．浓缩集菌经酸碱处理，消化，离心浓缩后可提高检出率。
3．分离培养与动物试验培养法阳性仍是结核病诊断的“金标准”，注意培养条件，时间（3~4周）等特点。
动物试验可将标本接种于豚鼠腹股沟皮下。
（五）防治
预防用BCG、治疗用抗痨药物，防止产生耐药性。
二、非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacterium)
非结核分枝杆菌所致疾病临床表现与结核病相似，以全身中毒症状和局部损害为主要表现，常见有非结核分枝杆菌肺病、淋巴结炎、皮肤病、骨病等。
艾滋病患者常并发非结核分枝杆菌的感染。
三、麻风分枝杆菌(M. leprae)
麻风分枝杆菌的形态、染色与结核分枝杆菌相似，在病人渗出物标本涂片中可见大量麻风分枝杆菌存在于细胞内，这种细胞的胞浆呈泡沫状，称麻风细胞，有诊断意义。
细菌的体外人工培养至今仍未成功。
主要通过破损的皮肤和粘膜进入人体，也可通过呼吸道，接触传播。
引起麻风病，根据临床情况分为两型（瘤型、结核样型）两类（界线类、未定类）。