IPTG诱导的外源蛋白表达

3 乳糖操纵元（lac operon来自百度文库的正调控


由于Plac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生 去阻遏使lac操纵元转录开放，还不能使细菌 很好利用乳糖，必需同时有CAP来加强转录 活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。 lac操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在又需 要没有葡萄糖可供利用。通过这机制，细菌 是优先利用环境中的葡萄糖，只有无葡萄糖 而又有乳糖时，细菌才去充分利用乳糖。
2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控


操纵子（o）序列位于启动子（p）与被 调控的基因之间，部分序列与启动子序列 重叠。 在乳糖操纵元中，调控基因lac I位于Plac 邻近，有其自身的启动子和终止子，转录 方向和结构基因群的转录方向一致，编码 产生由347个氨基酸组成的调控蛋白R。
2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控
2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控
2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控

当环境中有足够的乳糖时，乳糖受β-半乳糖苷 酶作用转变为别乳糖，别乳糖与R结合，使R 的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与 操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻 遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利 用乳糖的酶类，β－半乳糖苷酶在细胞内的含 量可增加1000倍。这就是乳糖对lac操纵元的 诱导作用。
3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控
3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控

在lac操纵元的启动子Plac上游端有一段序 列与Plac部分重叠的序列，能与CAP特异 结合，称为CAP结合位点（CAP binding site）。CAP与这段序列结合时，可增强 RNA聚合酶的转录活性，使转录提高50 倍。相反，当有葡萄糖可供分解利用时， cAMP浓度降低，CRP不能被活化，lac 操纵元的结构基因表达下降。
1 乳糖操纵元（lac operon）
1 乳糖操纵元（lac operon）

ｚ基因5’侧具有大肠杆菌核糖体识别结合位
点（ribosome binding site，RBS）特征的 Shan-Dagano(SD)序列，因而当乳糖操纵元 开放时，核糖体能结合在转录产生的mRNA 上。
1 乳糖操纵元（lac operon）
3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控


不难看出：CAP结合位点就是一种起正性调控 作用的操纵子，CAP则是对转录起正性作用的 调控蛋白──激活蛋白，编码CRP的基因也是 一个调控基因，不过它并不在lac操纵元的附 近，CAP可以对几个操纵元都起作用。 从上所述，乳糖操纵元属于可诱导操纵元 （inducible operon），这类操纵元通常是关 闭的，当受效应物作用后诱导开放转录。这类 操纵元使细菌能适应环境的变化，最有效地利 用环境能提供的能源底物。
2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控


当大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时， lac操纵元处于阻遏状态。此ｉ基因在其 自身的启动子Pi控制下，低水平、组成 性表达产生阻遏蛋白R，每个细胞中仅 维持约10个分子的阻遏蛋白。 R以四聚体形式与操纵子ｏ结合，阻碍 了RNA聚合酶与启动子Plac的结合，阻止 了基因的转录起动，从而阻遏了这群基 因的表达。
IPTG的作用原理

IPTG (isopropylthiog- alactoside): 化学合成 的乳糖类似物，很强的β －半乳糖苷酶诱导剂， 诱导乳糖操纵元(lac operon)的开放，自身不被 催化分解。类似的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β半乳糖苷)也是一种人工化学合成的半乳糖苷， 可被β－半乳糖苷酶水解产生兰色化合物，因 此可以用作 β－半乳糖苷酶活性的指示剂。 IPTG和X-gal都被广泛应用在分子生物学和基 因工程的工作中。
3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控

细菌中有一种能与cAMP特异结合的 cAMP受体蛋白CRP（cAMP receptor protein），当CRP未与cAMP结合时它 是没有活性的，当cAMP浓度升高时， CRP与cAMP结合并发生空间构象的变 化而活化，称为CAP（CRP-cAMP activated protein分解物基因激活物蛋 白 ），能以二聚体的方式与特定的 DNA序列结合。

由于ｚ、ｙ、ａ三个基因头尾相接，上一个基 因的翻译终止码靠近下一个基因的翻译起始码， 因而同一个核糖体能沿此转录生成的多顺反子 （polycistron）mRNA移动，在翻译合成了上 一个基因编码的蛋白质后，不从mRNA上掉下 来而继续沿mRNA移动合成下一个基因编码的 蛋白质，一气依次合成这基因群所编码所有的 蛋白质。
2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控
在这过程中乳糖（实际起作用的是 别乳糖）就是诱导剂，与R结合起到去 阻遏作用（derepression），诱导了利 用乳糖的酶类基因转录开放
3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控

细菌中的cAMP（环磷酸腺苷）含量 与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利 用葡萄糖分解产生能量时，cAMP生 成少而分解多，cAMP含量低；相反， 当环境中无葡萄糖可供利用时， cAMP含量就升高。
IPTG的作用原理
1 乳糖操纵元（lac operon）


大肠杆菌利用乳糖至少需要需要两个酶：促使 乳糖进入细菌的乳糖透过酶(lactose permease) 和催化乳糖分解第一步的β －半乳糖苷酶(β galactosidase)。 在环境中没有乳糖或其他β-半乳糖苷时，大肠 杆菌合成β-半乳糖苷酶量极少，加入乳糖或其 类似物2-3分钟后，细菌大量合成β -半乳糖苷 酶，其量可提高千倍以上，在以乳糖作为唯一 碳源时，菌体内的β-半乳糖苷酶量可占到细菌 总蛋白量的3%。
IPTG诱导的蛋白表达调控

操纵子（operon）： 原核生物中几个功能相关的结构基因成簇串联排 列组成的一个基因表达的协同单位（DNA序列）. 一个操纵子 =编码序列（2-6） +启动序列+操纵序列+(其他调节序列)



实验步骤： 接种 扩大培养 IPTG诱导 蛋白 提取、纯化 思考： IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用原理？
3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用

IPTG诱导的条件：
一般：0.5mM 28℃ 3.5hours 通过调节温度和IPTG的浓度，诱导表达质粒慢



转导，防止外源蛋白表达过快而形成包涵体。 影响大肠杆菌中获得高表达水平的重要因素 可能是生长温度，通过实验确定最佳温度，是 表达外源蛋白的关键。 表达量低 高温诱导 易形成包涵体 低温诱导
1 乳糖操纵元（lac operon）

乳糖操纵元含有ｚ、ｙ和ａ3个结构基因。 ｚ基因表达产物为β -半乳糖苷酶，催化乳 糖转变为别乳糖(allolactose)，再分解为 半乳糖和葡萄糖；ｙ基因编码半乳糖透过 酶，促使环境中的乳糖进入细菌；ａ基因 编码转乙酰基酶，以二聚体活性形式催化 半乳糖的乙酰化。
3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用
vector information
MCS region
3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用

IPTG诱导的表达载体必须以过表达lac阻遏物 的大肠杆菌为宿主，才能阻止外源基因在诱导 前的转录。由于大多数IPTG诱导的表达质粒 拷贝数很高（30~600），因此需要过量阻遏 物才能阻断基础表达（渗漏表达）。单拷贝的 q lac I 等位基因可以表达过量10倍的lac阻遏物 但是，如果外源蛋白对宿主的毒性非常强，或 q 者质粒拷贝数非常高，就需要将lac I 等位基因 克隆进表达质粒，确保紧密调节。
3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用

运用乳糖操纵元控制外源蛋白表达的 目的：
在需要菌体大量繁殖时，为了提供更 多的物质和能量确保菌体正常快速的生 长，需要将外源基因关闭。 菌体浓度达到要求时，可通过诱导使 菌体表达大量外源蛋白。
3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用


在我们所使用的PGEX载体中，插入了乳糖 操纵元的调控基因lac Iq和启动子Plac ，其后 紧接GST基因、外源基因。 这些基因头尾相接，上一个基因的翻译终止 码靠近下一个基因的翻译起始码，因而同一 个核糖体能沿此转录生成的多顺反子mRNA 移动，在翻译合成了上一个基因编码的蛋白 质后，不从mRNA上掉下来而继续沿mRNA 移动合成下一个基因编码的蛋白质，一气依 次合成这基因群所编码所有的蛋白质。