进行性家族性肝内胆汁淤积症2型患儿的基因诊断

PFIC3 型与 ABCB4 基因突变相关。ABCB11 基因突变 已经在不同人群的胆汁淤积综合征患儿中有过报道， 突变与表型的关联正被深入研究 [4,5]，而国内研究尚不 多见。本研究运用基因测序结合突变数据库，对怀疑 PFIC2 的患儿进行基因诊断并进行分析，以提高儿科医 师对该病的认识。
1 对象和方法
upset, increased levels of total bilirubin and direct bilirubin, GGT<100 U/L and high levels of total bile acid. Conclusions Genetic
diagnosis is a potent tool for clinical diagnosis of PFIC2.
Nanjing Medical University, Nanjing 210008, Jiangsu, China)
Abstract: Objectives To investigate the clinical features of progressive familial intrahepatic cholestasis type 2 (PFIC2)
（J Clin Pediatr,2013,31(10):905-909)
Key words: intrahepatic cholestasis; ABCB11 gene; bile salt export pump; genetic diagnosis
进 行 性 家 族性 肝内胆汁淤积 症（ P F I C）是 一组异 质 性 的常染 色体隐性 遗传 的肝 细 胞源性 儿 童 胆汁淤 积症 [1]。根据肝细胞胆汁转运基因突变的不同，PFIC 可分为 3 型。PFIC1 型及 PFIC2 型临床上常表现为血 清 γ 谷酰转肽酶（glutamyltransferase，GGT）水平正常 或低于正常，而 PFIC3 型则伴有较高的 GGT 水平。临 床体 征都 表 现 为 瘙 痒 和 黄 疸，伴或 不 伴 有肝 脾 肿 大 。 常规实验室检查及体检对于诊断的帮助有限 [2]。不同 PFIC 型的治疗及预后也不尽相同 [3]。因此，明确分型 对以后治疗及预后评估尤为重要。研究表明，ATP8B1 与 ABCB11 基因突变分别与 PFIC1 和 PFIC2 型有关，
PFIC2. The pathogenicity of the newly identified mutations were predicted by SIFT, PolyPhen-2, SNPs&GO software. The clini-
cal features and laboratory examinations were reviewed. Results Four disease-causing mutations, p.R928*, p.E554K, p.R575Q
1.1 研究对象 以 2012 年 1 月至 2012 年 11 月本院就诊的胆汁淤
积综合征患儿为研究对象。研究对象纳入标准：①患儿
通信作者：刘志峰 电子信箱：liuzfnj@hotmail.com
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临床儿科杂志 第 31 卷第 10 期 2013 年 10 月 J Clin Pediatr Vol.31 No.10 Oct.2013
R5'GTTGCTAACTGTACTCAGGA3'
Exon9
F5'CCCTGGATGAAGCTTACCAT3' R5'CATACTGCTAAAGGCTTGGG3'
504 F
Exon10
F5'AGTATCGCCCTTTCAACATG3' R5'GATGCTTTTTTCCTGAAGGC3'
and p.Y337H were identified, and the last three mutations were novel. These three kinds of novel mutations can cause the disease.
Two children with genetic diagnosis had such manifestations as onset within a month after birth, jaundice, hepatosplenomegaly,
摘要： 目的 探讨进行性家族性肝内胆汁淤积症 2 型（PFIC2）临床特点和基因诊断的临床意义。方法 采用多聚酶链 反应（PCR）和 DNA 直接测序方法，检测 6 例疑似 PFIC2 患儿编码胆盐输出泵（BEPS）蛋白 ABCB11 基因的 27 个外显子，新发 现的突变用 SIFT、PolyPhen-2、SNPs&GO 软件进行致病性预测；回顾性分析患儿的临床资料。结果 共检测到 4 种致病基 因突变：p.R928*、p.E554K、p.R575Q、p.Y337H，其中后 3 种为新发现的突变；经预测 3 种新发现的突变均可导致疾病。最终 2 例患儿符合 PFIC2 基因诊断。2 例患儿均于出生 1 个月内发病，表现为黄疸，肝脾肿大，偶有烦躁不安。血清总胆红素水平升 高，并以直接胆红素为主，γ 谷酰转肽酶（GGT）<100 U/L，总胆汁酸升高。结论 基因诊断有助确诊 PFIC2。
新发现的突变用 SIFT、PolyPhen-2、SNPs&GO 软件进行致病性预测，3 种软件以提供的相关蛋白单个 氨基酸的变化为基础，通过各自的算法运算后，判断该
表1 PCR扩增ABCB11基因外显子的引物序列和测序引物序列
ABCB11 基因 外显子
引物序列
产物 长度 (bp)
测序 引物
Exon2 F5'GACTGTGGCTTATCTTTCCTG3' 461 F
and to illustrate the importance of genetic diagnosis. Methods The mutations in 27 exons of ABCB11 encoding bile salt export
pump (BSEP) were identified using polymerase chain reaction (PCR) and direct DNA sequencing in 6 children with suspected
出生 3 个月内出现黄疸或瘙痒；②血生化显示直接胆红 素 >20%，或者如果总胆红素 <85.5 µmol/L，而直接胆 红素 >17.1 µmol/L[6]；③血清 GGT<100 U/L[7]。排除标 准：①实验室检查证实有细菌、病毒感染；②患儿表现为 多器官障碍或先天性畸形；③影像学检查为外科疾病。 本研究征得患儿家长同意及医院伦理委员会批准。 1.2 方法 1.2.1 临床资料收集 收集患儿临床资料、家系资料。 1.2.2 标本留取及 DNA 提取 留取 2 ml 外周静脉 血，EDTA 抗凝，–20℃保存备用。使用 TIANamp Blood DNA Kit，按照试剂盒操作说明书提取 DNA。 1.2.3 基因测序 ① PCR 扩增 ABCB11 基因参与编码蛋 白的 27 个外显子及其邻近内含子序列至少 10 bp 片段。 通过 Ensembl 网站（http://www.ensembl.org/index.html） 查找人类 ABCB11 参考基因为 ENSG00000073734，选择 转录 ID 为 ENST00000263817 的 ABCB11 基因外显子 分布为参考位置，使用 Primer 5.0 及 NCBI 的 PrimerBLAST 设计 PCR 反应引物，由华大基因公司合成，引 物序列见表 1。PCR 扩增体系，EX Taq HS(TaKaRa) 0.2 μl，DNA 模板 3 μl，dNTP mixture (2.5mmol) 4 μl， EX buffer (TaKaRa) 5 μl，上游引物 2 μl，下游引物 2 μl，ddH2O 补充体积至 50 μl。PCR 扩增条件，预变性 95℃ 5 min，变性 95℃ 30 s，退火 59℃ 30 s，延伸 72℃ 50 s，变性退火延伸循环 40 次，最后延伸 72℃ 10 min。 ② PCR 产物及测序引物送上海美吉生物医药科技有限 公司纯化后直接测序 ( 测序仪型号 ABI Prism 3730）。 1.2.4 基因分析 测序结果与正常人参考序列 ENSG 00000073734 在 NCBI 网站运用 nucleotide blast 工 具进行比对。发现基因突变则在 Mutation Taster 网 站（ ht t p: // w w w. m u t a t io nt a s t e r.o r g）查找是 否为单 核 苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP） 或致病突变。对突变可运用 ABCMdb 数据库（http:// abcmutations.hegelab.org）查找该突变的相关研究文 章。新基因突变使用 SIFT、PolyPhen-2、SNPs&GO 网 站预测突变对 ABCB11 基因编码的胆盐输出泵 (bile salt export pump，BSEP) 蛋白生物特性的影响。内含 子 / 外显子交界区 10 bp 内（剪接位点）的核苷酸改变使 用 NetGene2 Server 网站（http://www.cbs.dtu.dk/services/ NetGene2）判断是否有剪接位点的改变。对于检测到致 病突变的外显子重复进行 3 次 PCR 扩增及测序。 1.3 统计学分析
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doi:10.3969 j.issn.1000-3606.2013.10.002
·论 著·
进行性家族性肝内胆汁淤积症2型患儿的基因诊断
胡国瑞1,2 郑必霞2 刘志峰1,2 金 玉1,2 1. 南京大学医学院 (江苏南京 210093)；2. 南京医科大学附属南京儿童医院 (江苏南京 210008)
R5'GAAGGAAACTTGAGGCAGAG3'
Exon6 F5'GGTACCATGAGGTCTGTTTAG3' 431 F
R5'CAGACTGTAGTTCTTAGGGC3'
Exon7
F5'CCTGCTGAAGGTTCTGTTTA3' R5'ACACACCAAATTGCAGTACC3'
543 F
Exon8 F5'GATCTGAGAGGCTGTTAATGC3' 414 F
[ 临床儿科杂志 ,2013,31(10):905-909] 关键词： 肝内胆汁淤积； ABCB11基因； 胆盐输出泵； 基因诊断 中图分类号： R725 文献标志码： A 文章编号： 1000-3606 (2013) 10-0905-05
Genetic diagnosis of progressive familial intrahepatic cholestasis type 2 HU Guorui1,2, ZHENG Bixia2, LIU Zhifeng1,2, JIN Yu1,2 (1.Medical College of Nanjing University, Nanjing 210093, Jiangsu, China; 2.Nanjing Children’s Hospital,
R5'CGTTACATGGATTCTAGGGAG3'
Exon3
F5'GAGTAAAGGTAGCAGCACTC3' R5'GGGGACATTTGAACCTAACC3'
500 R
Ex源自文库n4
F5'CGCTAGTGAACCTGAGATTG3' R5'GATAACCATGGGCTTAGTGA3'
519 F
Exon5 F5'CTCTGCCACTCAATTAAGGTG3' 550 F