southern blot的中文操作步骤

一. 地高锌-DNA 标记

1. 用51-4全长质粒做模板,用BspQ I 和Sca I双酶切,

NEBBuffer：10 μL

BspQ I： 3 μL

Sca I ： 2 μL

质粒：60ul

水：25μL

100μL体系

先放于37℃的培养箱10小时,然后于50℃水浴, BspQ I作用的温度为50℃, Sca I作用温度为37℃.

2.胶回收全长片段(

3.2kb)

1．100μL酶切产物加loading buffer全上样，电泳后回收3000bp左右的片段。

2．称重加入3倍体积的QG（1g/3mL），50℃水浴10min融胶,其间颠倒2-3次。

3．将液体转移至柱子，13000rpm/min 1min，弃滤液。

4．加入500μLQG，13000rpm/min 1min，弃滤液。(去除痕量的融胶)

5．加入750μL PE，静置5min，13000rpm/min 1-2min.

6．13000rpm/min空离2min

7．置一新EP管上，加入40μL ddH2O，静置10min，13000rpm/min 1min，收集滤液备用。用2ul测OD值.(51-4含量:0.28ug /ul)

3. 探针反应

用H2O 或Tris buffer溶解模板(胶回收的51-4),不能用TE,因为EDTA会抑制探针反应.

步骤:

1.取4ul 51-4胶回收产物,加双蒸水至16 ul.

2. 100℃沸水中放置10min变性,冰上骤冷.

3. 混匀DIG-High prime,取4ul DIG-High prime加到上述变性DNA溶液中,混匀,短暂

离心,37℃孵化20小时

4. 65℃水浴10min

二.标记效率的检测

1.倍比稀释探针

探针反应后的探针量为23000ng .1000ng 模板→20h →probe 2300ng/20ul≈100ng/ul①

第一次稀释：10ul probe①加入90ul DNA dilution buffer(10ng/ul)②

第二次稀释：5ul ②加入45ul dilution buffer (1ng/ul)③

第三次稀释：

(2) Control DNA (5ng/ul)的倍比稀释

吸取5 ul Control DNA (5ng/ul)加入20 ul的DNA dilution buffer(1 ng/ul)

2.点膜

(1)取1 ul Control DNA D2-D8点于尼龙膜上,与其相平行的一排点上地高辛标记的

DNA D2-D8,最后各点一个dilution buffer.如下图所示.

O O O O O O O O Control

O O O O O O O O Dig

D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 dilution buffer

将尼龙膜放于滤纸上,在其上再放一张等大的滤纸,于80℃烤箱烘烤2 hour.拿出于室温放置.

(2)将膜转移到含有20ml washing buffer的封口袋中,室温振摇2min,弃尽washing

buffer

(3)加10 ml 1XBlocking solution振摇孵育30 min, 弃尽Blocking solution

(4)加10 ml 稀释了104倍的antibody solution振摇孵育30 min,弃antibody solution

(5)加10 ml 1Xwashing buffer 洗膜两次,2X15 min,弃washing buffer

(6)加10 ml 1Xdetection buffer振摇平衡2-5 min

(7)将膜取出放入有双层薄膜的一层薄膜上,加约4滴的CSPD ready-to-use 横跨尼

龙膜表面,将袋子的第二层膜盖在含探针DNA的一层薄膜上,尽量不能有气泡.

(8)室温孵育5 min(吸尽过量的液体,将薄膜四边封口)

(9)37℃孵育10 min

(10)进入暗室,压膜一定时间,把压好的片子先放于以1:9稀释好的100 ml的显影液中

显影5 min左右,拿出来放入定影液中定影5 min左右,用水冲洗干净,白光下照相.

3.探针结果分析

A.D6的荧光强度为理想的标记DNA,如:DNA样品按上述方法稀释的,实际上含有

20ng/ul标记探针.

B.D5 出现荧光,是足量的标记DNA,如: DNA样品按上述方法稀释的,实际上约含

有7 ng/ul标记探针

C.D4出现荧光,标记DNA不够(确定DNA探针量后再进行下一步)

D.计算出探针浓度后看需要多少的探针溶液来杂交,如:D6做探针时,每ml杂交

buffer用1.25ul的20ng/ul DNA探针溶液在Southern blot检测DNA,D5做探针时,

每ml杂交buffer用3.75ul的7 ng/ul DNA探针溶液(25 ngDNA 探针) 在Southern

blot检测DNA,D4不能当探针,重做一个.

三. 探针杂交

southern blot DNA探针的杂交

流程

在琼脂糖上分离DNA样品条带(30min-2h)

↓

转移DNA到尼龙膜上(southern blot)

A.脱嘌呤和变性DNA(1h)

B.用毛细管转移DNA到尼龙膜上(过夜)

C.烘烤固定DNA(30 min-2h)

↓

用DIG-Easy Hyh进行预杂交(30 min)

↓

DIG-labeled DNA与DNA进行杂交

A.孵育标记了DNA探针的尼龙膜(4-16h)

B.洗膜,将未杂交的探针洗掉(45 min)

1.DNA的电泳分离

(1)用TBE配置一块琼脂糖凝胶,胶越薄越好.(注:为了得到理想结果,在胶里不能放EB染色或跑过的buffer,(Ethidium)乙啡啶,假如电泳条带跑的不够长可能会引起背景不均匀的问题. (2)点上少量目的DNA,一般地,目的DNA的浓度要低,如:每个泳道点2.5-5ug人类基因组DNA 或假如基因组比人类DNA还复杂的,每个泳道就跑10ug以上或每个泳道跑<1ng的质粒DNA (3)点上分子量的Marker,相应的每泳道点上5ul的DIG-labeled DNA Marker.(注:需要量依赖于杂交产量,确保点的Marker量足够显示出样品同样位置的条带.

(4)跑胶直到DNA分离的很好,用30-50V电压跑胶大约5h左右.

(5)为了评价目的DNA 的质量,以0.25-0.5ug/ml EB染色,在紫外灯下成像.(15-30 min)

2.把DNA转移到尼龙膜上

1).凝胶里变性DNA:用变性溶液(0.5M NaOH,1.5M NaCI)浸没凝胶2X15 min,室温温和振摇,之间用无菌双蒸水冲洗凝胶.

2).中和:用中和液(0.5M Tris-HCI,PH 7.5;1.5M NaCI )室温浸没凝胶振摇2X15 min ，之间用无菌双蒸水冲洗凝胶

3).用20XSSC平衡凝胶,振摇至少10 min

4).按照下述进行blot,避免产生气泡:

●放一张已经沾有20XSSC溶液的Whatman 3 MM纸于桥上,然后往槽里放20XSSC

●把凝胶放在浸湿了的Whatman 3 MM纸上,用无菌吸管在凝胶与纸之间吸走所有气泡

●剪一块与凝胶大小的尼龙膜

●放这张膜于含有DNA的凝胶上,按上述方法用移液器消除气泡

●然后再加上一层Whatman 3 MM纸,一叠纸巾,一快玻璃板和一个重200-500g的重物,完

成印记转移的三明治模式.

5).印记过夜在20XSSC溶液里转移，如图示