实验4 细菌革兰氏染色法知识讲解

【方法步骤】
1. 涂片：将大肠杆菌（16h）和金黄色葡萄球菌（16h）分别 涂片、干燥、固定。 2. 染色： 1）初染：加草酸铵结晶紫一滴（以刚好将菌膜覆盖为宜）， 染色1～2min后倾去染液，水洗至流出水无色； 2）媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min， 倾去碘液，水洗至流出水无色。 3）脱色：用滤纸吸去玻片上的残水（从边缘吸，以防擦去菌 体），将玻片倾斜，并衬以白背景，用95%乙醇滴洗至刚刚无紫 色为止，约20～30秒，立即用水冲去乙醇；
图4-1 革兰氏阳性菌和阴性菌细胞壁比较
【实验用品】
1. 菌种：大肠杆菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，金黄色 葡萄球菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。
2. 试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏（Lugol） 碘液，95%乙醇，番红复染液等。
3. 仪器和其他用品：酒精灯，载玻片，显微镜，双层瓶（内装 香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，试管架，镊子，载玻 片夹子，载玻片支架，滤纸，滴管和无菌生理盐水等。
实验4 细菌革兰氏染色法
课前提问与目的要求
【课前提问】
1.油镜的特点及使用范围是什么？ 2.革兰氏染色的原理是什么？
【目的要求】
1. 学习并掌握油镜的原理和使用方法； 2. 了解革兰氏染色原理； 3. 学习并掌握革兰氏染色的方法。
【基本原理】
1. 油镜提高分辨率
油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间是隔一层油质。
【基本原理】
革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低， 肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩 而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。 而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且 脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先 滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为 无色，用复染剂（如番红）染色后又变为复染剂颜色（红）。
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Central laboratory of Biology
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如香柏油的折射率n=1.52，与玻璃相同。
a)光线通过不减低视野的照明度；
b)更主要能增加数值孔径，提高显微镜的放大效能。
c)
分辨率=λ/2NA
λ=光波波
d) （物镜的数值孔径值）NA=n×sinα α=镜口角的半数
★可知n（介质折射率）对提高显微镜的分辩力起着关键性的作
用。
【基本原理】
2. 革兰氏染色 革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性 （G-）两种类型，细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们 细胞壁的成分和结构不同而造成的。 首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝 紫色。然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶 紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。 之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果 不同。
【方法步骤】
4）复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色 2min，水洗，吸去残水晾干（图4-1）。 3.镜检：干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色为准，革兰 氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 4.混合制片观察：一载玻片上两种菌混合制片，对比观察。菌 龄和脱色程度对染色结果影响较大。
【实验报告】
1. 结果 1）绘出油镜下观察的混合区菌体图像。 2）填表
表4-1 结果记录表
菌名
菌体颜色
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
细菌wk.baidu.com态
结果（G+,G-）
【实验报告】
2. 思考题 1）革兰氏染色是否成功，有哪些问题需要注意，为什么？ 2）现有一株未知杆菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴定该 菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴性，如何确定你染色结果的正确 性？ 3）为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性？ 4）你认为革兰氏染色法中哪个步骤可以省略？在何种情况下 可以省略？
【方法步骤】
A. 初染 B. 水洗 C. 媒染 D. 水洗 E. 脱色 F. 水洗 G. 复染 H. 水洗 I. 吸干
图4-1 革兰氏染色程序
【方法步骤】
★获得本实验成功的关键： 1）选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染
成红色而造成假阴性。 2）涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。 3）脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，
脱色过度造成假阴性。
【实验结果】
图4-2 大肠杆菌染色结果 图4-3 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合染色结果
【注意事项】
★涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜 过热（以玻片不烫手为宜）。 ★加热时使用载玻片夹子及试管夹，以免烫伤。 ★使用染料时注意避免沾到衣物上。 ★使用乙醇脱色时勿靠近火焰。 ★实验后洗手。