血清总胆固醇测定

加毕，混匀，静置10分钟后，以对照管校0于550nm测 定吸光值，从标准曲线中查出相应的浓度。
• 吸光度与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比，称
为朗伯—比尔定律，简称比尔定律，即光的吸收 定律。
• 吸光系数的大小，取决于物质(溶质、溶剂)的本性和光的波
长。 1. 物质不同，则吸光系数不同，所以吸光系数可作为物质的 特性常数。在分光光度法中，常用摩尔吸光系数ε来衡量显 色反应的灵敏度，ε值越大，灵敏度越高。 2. 溶剂不同，其吸光系数亦不同， 3. 光的波长不同，其吸光系数亦不同。如将不同波长的单色 光依次通过被分析物质，分别测得吸光度，然后绘制吸光 度—波长曲线，称为吸收曲线(absorption curve)，吸收曲 线上有极大值 的部分，称为吸收峰。吸收峰所对应的波长， 称为最大吸收波长，以符号λmax表示 ，这是物质定性的依 据之一。 4.单色光的纯度也影响吸光系数。单色光越纯，即经单色器分 光后的波长范围越窄，其吸光系数越大。
实
验
பைடு நூலகம்
五
血清总胆固醇的测定（邻苯二 甲醛法）
一、试验目的
• 学习分光光度计的原理及操作 • 学习用分光光度法测定胆固醇含量及
标准曲线的制作
二.
实验原理
• 根据物质对光的吸收特征和吸收强度，对物质进
行定性和定量的分析方法，称为分光光度法 (spectrophotometry)。该法具有一定的灵敏度和准 确度，分析手续较简便快速，仪器设备也不复杂， 故应用很广。
•
四、操作步骤 五.实验结果 六.结果讨论
管号
0
1 0.3
2 0.2
3 0.1
4 0
X(样品) 0.3
醋酸 0.4 液（毫 升） 标准胆 0
固醇 （毫升）
邻苯二甲
0.1 0.2 4
0.2 0.2 4
0.3 0.2. 4
0.4 0.2 4
0.1 血清 0.2 4
0.2 醛（毫升）
混合酸 （毫升）
4
•
定量方法 ： 1. 吸光系数法 2. 标准曲线法 不是任何情况下都能适用的。特别是在单色光不 纯的情况下，测得的吸光度值可以随所用仪器不 同而在一个相当大的幅度内变化 不定，若用吸光 系数换算成浓度，则将产生很大误差。 先配制一系列浓度不同的标准溶液，在测定条件 相同情况下，分别测定其吸光度，然后以标 准溶 液的浓度为横坐标，以相应的吸光度为纵坐标， 绘制A—C关系图，在相同条件下测出样品溶液的 吸光度，就可以从标准曲线上查出样品溶液的浓 度。 3. 对照法
醋酸 • 4. 0.1mg/ml标准胆固醇应用液 • 5. 兔血清
注意
• 本实验所用的混合酸均为浓酸，使用中一定要注
• •
意安全。 测定时比色杯中溶液体积不能超过高度的2/3。 不能将测定的反应液洒入分光光度计内。若有洒 落到桌凳仪器上需立即擦除，以免发生伤害 胆固醇、醋酸；混合酸分别用0.5mL、5mL干洁的 刻度吸管量取，不要混用。邻苯二甲醛、血清用 移液器量取。
二、基本原理
• 胆固醇及其酯在硫酸存在下与邻苯二甲醛
作用，产生紫红色物质，此物质在550nm有 最大吸收值，可用比色法测定。 • 胆固醇含量在400mg/100ml之内与吸光度呈 现良好线性关系。 • 本法操作简便，灵敏、稳定。
三、试剂
• 1. 邻苯二甲醛试剂 • 2. 90%醋酸 • 3. 混合酸：等体积浓硫酸+等体积90%
• 标准曲线的制作
（1）配置一系列浓度不同的 标准溶液。 （2）在测定条件相同的情况 A 下，分别测定其吸光度。 （3）以标准溶液浓度为横坐 标，以相应的吸光度为纵坐 标，绘制A-C关系图。 （4）在相同条件下测出样品 Ax 溶液的吸光度，从标准曲线 上查出浓度。 0
Cx
C
• 定性方法
将一系列不同波长的单色光，照射到含待测组分 的溶液，可测得相应的一系列吸光度。如果 以吸光 度为纵坐标，以波长为横坐标作图，便可得到该待 测物质的吸收曲线。由于每一种物质均有其特征的 吸收曲线，故可与其标准品比较而定性。但在实际 工作中常用λmax 和ε来定性，λmax可从吸收曲线 中吸收峰所对应的波长直接找出；ε通常需配制待 测物质三种不同浓度的溶液，于1cm吸收池中，在 λmax处分别测定其吸光度，根据A= εbc,即 ε=A/bc，计算出ε，将三次结果平均，即得该物质 的摩尔吸光系数。