蔗糖酶的提取和纯化步骤

蛋白含量的测定：
样品的测定：取两支试管（平行）各加入样品液（稀 成一定浓度的）1ml ，其他操作（反应和比色测定）同 工作曲线的制作。 蛋白质浓度的计算：
A650值对应的µ g数(Pr)×10-3 ×稀释倍数 Pr溶液的ml数
Pr (mg/ml)=
测定E1蛋白含量（大约稀释200、100倍），测定E2蛋白 含量（大约稀释50、20倍），测定E3蛋白含量（大约稀 释50、20、10倍），用去离子水稀释即可。
线的时候，将电流改为20mA （如果同时电泳两块胶，电流恒定在
40mA ） ，电压设定在220V。溴酚蓝距凝胶下边缘约5mm时，停止 电泳。
9. 凝胶板剥离与染色：电泳结束后，将上样槽的电极缓冲液倒入特定
容器，取下电泳胶玻璃板，用楔形工具小心将玻璃板撬开，将凝胶 做好标记，切除浓缩胶并冲洗后放在大培养皿内，加入染色液，染
兔肌动蛋白
牛碳酸酐酶
MW=43,000
MW=31,000
胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100
鸡蛋清溶菌酶
MW=14,400
• 根据说明书处理标准蛋白
制E3
①
实验操作
样品准备：将透析液 4℃ 8000r/min 离心5min，弃沉淀取 上清 E2，量体积 V2（约 =14ml ）， 留出 2ml 置于冰箱中保存 ， 其他酶液准备用离子交换柱纯化。 (2 只离心管 / 组， 1 支配 平) 调节：上样前打开紫外检测器 ( 与柱相连 ) 与记录仪，按照 第2天参数调节仪器。 上样：先将黄枪头慢慢拔出，再将胶塞慢慢拔出（尽量不 要晃动），打开阀门将柱中的5mmol/L pH6.0缓冲液逐渐放 出。当液面接近柱床表面时，用长吸管沿柱壁绕环小心加 入 E2（不要冲坏柱床表面）；打开离子交换柱出口处的阀 门，使样品缓慢、均匀地进入柱床，打开截流阀，注意控 制流速，使流出液的流出速度为1.5ml/min左右。 洗柱：样品全部进入床面后，在柱面加入2cm的缓冲液，在 储液瓶中加入5mmol/L pH6.0的磷酸缓冲液，打开截流阀， 洗出未吸附的杂蛋白。目测记录仪上的紫外吸收峰及其余 部分的酶活力（ 5ml/ 管），检查流出液中是否有酶活力存 在（即酶是否挂在离子交换树脂上）。洗柱体积控制在5个 柱体积左右（约35ml）。
2. 酶活力的测定：从两个反应试管中各取出 0.5ml 溶液放入血 糖管中，加入 3ml 3,5 二硝基水扬酸试剂和 1.5ml 水，摇匀， 于沸水浴中准确反应 5min，立即用冷水冷却，加水稀释至 25ml，摇匀，于540nm处测光密度。 3. 酶活力计算：在葡萄糖标准曲线上找到所测定光密度值对 应的葡萄糖含量毫克数，按下面公式计算酶活力：
检测仪后面调 280nm 档位
流动相要下进上出
① 透过率 T为 095
② 0.5A 调吸光度005
三、走纸记录仪
⑥放下记录笔
⑤调零 ⑦开始测量
③走纸速度 6cm/h ②电源开关 ①与紫外连接 ④量程 100mV
E1、E2、E3酶活力及蛋白质浓度的测定
酶活力的测定：
1 ． 样 品 前 处 理 ： 测 定 E1 、 E2 、 E3 酶 活 时 ， 用 pH4.6, 0.2mol/L的醋酸缓冲液进行稀释。（E1稀释5倍、10倍、 20倍；E2稀释50倍、100倍; E3稀释20倍，50倍）
去离子水至满，静置30分钟。 ※凝胶配制过程要迅速，促进剂TEMED要在注胶前再加入， 否则凝结无法注胶。注胶过程一次性完成，避免产生气泡。
※ 水封的目的是为了使分离胶上沿表面平直，并排除气泡
※ 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面. 3.制备浓缩胶：倒出分离胶上面的水，并用滤纸把剩余的水分吸 干,按比例（见SDS-PAGE 各部分凝胶配制）配好浓缩胶，连续平 稳加入浓缩胶至满,立刻插入样梳，静置30分钟. ※ 样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平. 4.玻璃胶板的安装：将玻璃胶板固定到上样槽上，加入电极缓冲
Buffer
10%SDS 10%Ap TEMED
6、样品预处理：
低分子量蛋白Mark,E1,E2,E3,E4,牛血清白蛋 白。 （1）低分子量蛋白Mark、牛血清白蛋白和E4的样品 由实验室提供。
（2）E1,E2,E3,E4分别取20µ l，再加入20µ l 2倍 (2X)样品缓冲液，在沸水中煮3分钟(本次实验1个 E3、E4-1和E4-2由实验室提供)，点动离心除沉淀。
蔗糖酶米氏常数的测定操作方法
1）将离子交换柱层析得的E3稀释(pH4.6 HAC缓冲液)至20U/mL，共16ml。 2）取试管8支，按0--7编号，0为对照管。 3）按表 1将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于35℃水浴中保温（使 温度平衡，以下同）10min。
4）取约16ml酶液，放入同一水浴中保温约10min。
吹干)，把玻璃板在灌胶支架上固定好（固定玻璃板时，两边用
力一定要均匀，防止夹坏玻璃板，方向）。准备2个干净的 100ml的烧杯； 2. 配制分离胶：按比例（见SDS-PAGE 各部分凝胶配制）配好 分离胶，用1ml移液器将胶液快速加入到玻璃板的夹缝中，注
胶量约3ml，高度约5厘米（加至板夹上沿），之后迅速加少许
液，内槽距离顶端约5mm，没过短板，确保不漏液后拔出样梳。
※ 要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果. 5.加样（详见7）
SDS-PAGE-各部分凝胶配制
分离胶(10% 5ml) H2 O 30%Acr 2.6ml 1.7ml 3.0mol/L pH=8.8 Tris-HCl 0.6ml 0.05ml 0.05ml 3.0µl 浓缩胶(5% 3ml) 1.7ml 0.5ml 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 0.76ml 0.02ml 0.02ml 3µ l
②以1号管为参比调零，记录光密度值A650，以标准液的浓度为横坐 标， A650值为纵坐标，画出工作曲线。
蛋白含量测定的计算
Pr (mg/ml)=
A650值对应的µ g数(Pr)×10-3 ×稀释倍数 Pr溶液的ml数
BSA标准液 250 µ g/ml
SDS-PAGE电泳实验过程
1. 准备玻璃板：将玻璃板用蒸馏水洗净晾干(实验室前后的空调
实验操作
蔗糖酶粗品(E1)的制备：
取出样品 ,4℃ 8000r/min 离心 10min, 弃沉 淀及脂层（先用玻璃棒将脂层拨到一边）， 用滴管取得无细胞提取液 E1 （中间层），约 量得体积 V1=（60-70）mL。取 2ml 放冰箱保 存用于测定酶活和蛋白浓度。
乙醇分级和透析（制E2）： ①调pH值:测E1pH、用稀HAC调 pH至4.5(注意少量、慢加、搅匀，防止调过， 约2-3滴，用0.5-5的精密试纸调。试纸用完后扔到垃圾桶中！) ②第一次乙醇分级（32%乙醇饱和度） 计算出使E1的乙醇浓度达32%时，所需95%乙醇的体积X1，将E1和乙醇X1， 放入冰盐浴（冰放1000ml烧杯2/5, 盐放1勺，再加100ml水）中预冷， 在不断搅拌下，缓慢滴加乙醇,4℃ 8000r/min ，离心10min，弃沉淀，留 上清！量取上清体积为Vm. ③ 第二次乙醇分级（47.5%乙醇饱和度）： 同上法加入X2（为达47.5%乙醇饱和度时需要补加的 95%乙醇的体积）， 4 ℃ 8000r/min 离心 10min，弃上清，取沉淀！！立刻用 10ml 5mmol/L pH6.0 的 磷 酸 buffer 溶 解 ， 装 入 透 析 袋 （ 截 止 分 子 量 一 万 的 ） ， 用 5mmol/L pH6.0 的磷酸 buffer 透析 ( 用 1000ml 烧杯， buffer 浸没透析袋 ) ， 16:00 换一次5mmol/L pH6.0的磷酸buffer过夜 两次加入乙醇体积的计算公式为： 第一次：X1*95%=(V1+X1)*32% X1=32V1/63 第二次：X2*95%+Vm*32%=(Vm+X2)*47.5% X2=31Vm/95
[E] = (葡萄糖mg数×(4.5/0.5)×E的稀释倍数/2ml)/2
蔗糖酶活力的规定：在本实验条件下，每3分钟释放1毫克 还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。 注意：在测定E1、E2、E3酶活力和蛋白浓度时，应留取少许样 品（100μml左右），留作电泳实验。 注：在正交试验的测定中，共需稀释到50U/mL的E3约为12mL。
Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作 ①取7支试管（干燥）按下表中顺序加入各种试剂并进行反应和测定 试管号 蛋白质标准溶液(ml) 去离子水 Folin甲试剂 1 2 3 4 5 6 7
0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 室温下振荡10min（先涡旋一下，后手摇即可） Folin乙试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 立即摇匀，于55℃水浴中保温5min，用冷水冷却1min,650nm处测吸光度A650
⑤
⑤
将酶活力峰峰尖处的样品 2ml 交给老师，（老师浓缩后用 于凝胶层析）；
合并其它剩余酶活力峰得到E3，量出总体积V3。
⑥
DEAE52离子交换树脂层析准备（制E3）：
装柱：先除死体积。本实验使用DEAE52离子交换树脂，把柱内装 1/3 5mmol/L pH6.0 磷酸起始缓冲液，把柱子垂直固定（调流 速小于 2ml/min ）；（调流速同时，将 DEAE52 离子交换树脂用 起始缓冲液搅匀后连续加入，柱内的DEAE52离子交换树脂应非 常均匀地分布，防止出现截面和气泡，床面要平整，床高至 黑色标记处；用起始缓冲液洗柱,控制好流速。 平衡：用5mmol/L pH6.0的磷酸起始缓冲液平衡(流速1ml/min)，6 个以上柱体积(约35ml), 连接仪器:连接紫外检测器(与柱相连)与记录仪，并调试
② ③
④
目测酶活力方法：取两支血糖管，各加入1ml 5%蔗糖液，然 后于一支中加入1ml起始缓冲液，另一支中加1ml洗柱流出 液，同时于35℃恒温水浴中进行水解反应3min，然后各加 DNS 试剂1ml，于沸水浴中反应5min ，比较两支试管颜色 的深浅。
④
洗脱：本实验用阶段洗脱进行。用含 0.15mol/L NaCl 的 0 . 0 0 5 mol/L pH6.0 的 磷 酸 缓 冲 液 1 0 0 ml， 控 制 流 速 为 1.5ml/min ,用小试管收集（5ml/管，收集7管左右即可）。 收集酶活力峰：目测记录仪上的蛋白峰的酶活力，确定酶 活力峰的位置（蛋白峰不一定是活力峰）。
色1小时。
10. 脱色：回收染色液，凝胶板先用水漂洗数次，再用脱色液脱色，直 到蛋白质区带清晰。确定目的蛋白条带位置，估算分子量，比较不
同纯化过程对杂蛋白去除状况。
※剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。
低分子量标准蛋白试剂盒:
•
低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B 牛血清白蛋白
MW=97,400 MW=66,200
7、加样：用移液器向电泳道中加样，进样枪头要抵 到泳道表面，但是不要刺破胶的表面，进样要缓 慢，不要使样品漂出泳道外面。。
E1
E1
E2
E2
Mark 牛血 E3 清白 蛋白
E3
E4-1 E4-2
20ul 10ul 20ul 10ul 10ul
10ul 15ul 15ul 15ul 15ul
1
10
Βιβλιοθήκη Baidu
8. 电泳过程：将上样槽装入电泳槽，向电泳槽中加入电极缓冲液，接 通电源，进行电泳。开始电流恒定在10mA（如果同时电泳两块胶， 电流恒定在20mA ），当样品在分离胶与浓缩胶之间被压成一条直
取两支试管分别加入用 pH4.6,0.2mol/L 的醋酸缓冲液适 当稀释过的酶液2ml； 一支中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，摇匀，使酶失活（对 照取E1 20倍稀释 1管即可）； 另一支做测定管； 把两支试管和 5% 的蔗糖溶液放入 35 ℃水浴中预热恒温 （10min）； 分别取 2ml 5% 的蔗糖加入上述两试管中，开始计时，准 确反应3分钟，于测定管中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，摇 匀，终止反应。