肝脏中转氨酶活力的测定
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实验九肝脏中转氨酶活力的测定
一、实验目的
1. 了解转氨酶的性质和临床意义;
2. 掌握谷丙转氨酶活力的测定方法
二、实验原理
本实验以丙氨酸的氧化脱氨基为例,分别测定谷丙转氨酶,谷氨酸脱氢酶活性外,又通过抑制剂观察肝组织中的联合脱氨基作用。在谷丙转氨酶的催化下,丙氨酸和α-酮戊二酸作用生成丙酮酸和谷氨酸。次反应可逆,平衡点近于1.0无论正向反应或逆向反应皆可用于测定此酶的活性,既可测定所产生的氨基酸,也可以测定生成的酮酸,因此可有多种测定方法。
本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸作为谷丙转氨酶作用的底物,利用内源性磷酸吡哆醛作为辅酶,在一定条件及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定其酶活力。丙酮酸能与2,4-二硝基苯肼结合,生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙,后者在碱性溶液中呈现棕色,其吸收峰为439-530nm,可用于测定丙酮酸的含量。
α-酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯肼结合,生成相应的苯腙,但后者在碱性溶液中吸收光谱与丙酮酸二硝基苯腙有差别,在520nm波长比色时,α-酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远较丙酮酸二硝基苯腙为低(约相差3倍)。经转氨基作用后,α-酮戊二酸减少而丙酮酸增加,因此在波长为520nm 处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸和α-酮戊二酸的摩尔浓度呈线性关系,故可借此测定谷丙转氨酶的活力。
三、实验材料、试剂和仪器
(一)材料与试剂
猪肝脏、乙醇、0.4mol/LNaOH
标准丙酮酸溶液(1mL 相当于500μg):准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg,溶于100mL 的0.05mol/L的H2SO4中,此液需临用前配制。
谷丙转氨酶底物:称取L-丙氨酸0.90g 及α-酮戊二酸29.2mg,先溶于pH7.4 的0.1mol/L 磷酸缓冲液中,然后用1mol/L NaOH 调至pH7.4,再加pH7.4 的0.1mol/L 磷酸缓冲稀释至100mL,贮藏于冰箱内,可保存一周。(试验了一下pH 接近7.5,中间未调整pH 值)
0.1mol/L 的磷酸缓冲液(pH7.4):称取13.97gK2HPO4(如果是K2HPO4·∙H2O,则需称取18.31g)和2.69gKH2PO4 溶于1000mL 蒸馏水中。
0.02% 2,4-二硝基苯肼溶液:称取2,4-二硝基苯肼20mg 溶于少量1mol/L 盐酸中,加热溶解后,利用1mol/L 盐酸稀释至100mL。
(二)仪器/器具
电子天平、分光光度计、剪刀、移液管、组织破碎机
四、实验步骤
1. 肝匀浆制备与稀释
将猪肝用生理盐水冲洗,滤纸吸干,称取肝脏0.5g ,剪成小块,置于烧杯内,加入4.5mL 预冷的pH7.4的0.1mol/L 磷酸缓冲液,制成10%肝匀浆,冰冻保存备用。吸取上述肝匀浆1mL ,加入预冷的pH7.4 的0.1mol/L 磷酸缓冲液49mL (即稀释50 倍)摇匀,作为实验中使用的稀释肝匀浆(室温中放置时间过久,会引起酶活性下降或失活因此需现用现配制,且放置时间不宜过久)。
2. 谷丙转氨酶活力的测定
(1)取试管4 支,分别标“测定管A”、“对照管B”、“标准管S”,“空白管”按下表进行操作。
测定管A 标准管S 对照管B
空白管O
谷丙转氨酶底物/mL
0.5
0.5
37℃ 保温5 min
稀释肝匀浆/mL
0.1
标准丙酮酸0.1
0.1
H 2O 0.1
混匀后,37℃水浴准确保温30min
0.02% 2,4-二硝基苯肼 0.5 0.5 0.5 0.5 谷丙转氨酶底物/mL
0.5
0.5
混匀后,37℃水浴准确保温20min
0.4mol/LNaOH
5.0
5.0
5.0
5.0
(2)混匀后,静置10min ,于520nm 波长处进行比色,以空白管调零,读取测定管A 、对照管B 、标准管S 的吸光度,将测定管A 吸光度减去对照管B 吸光度后与标准管S 相比算出其相当之丙酮酸含量。
(3)谷丙转氨酶活力计算:本法规定酶在37℃与底物作用30min 后,能产生2.5μg 的丙酮酸的酶量为一个谷丙转氨酶活力单位(U )。
五、实验结果
1. 每毫升稀释肝匀浆谷丙转氨酶活力单位:
其中,D ——每毫升稀释肝匀浆谷丙转氨酶活力单位(U/mL ),即肝匀浆的比活;
A ——样品管的吸光度值;
B ——对照管的吸光度值; S ——标准管的吸光度值; 500——标准丙酮酸溶液的浓度; 2.5——谷丙转氨酶换算单位系数。 2. 每克肝脏谷丙氨酶的活力单位
测定管A 标准管S 对照管B 空白管O 520nm 吸光值
0.102
0.170
0.032
0.000
=82.353
=20588.235
六、实验分析
1、实验中的猪肝匀浆液要放置冰柜,室温放置太久酶活性会降低,会影响酶的测定。
2、溶液量取过程中产生很多误差。
3、保温完后下一步骤衔接不够紧凑,时间间隔导致温度稍有下降,造成酶活性降低。