如何做好Westernblot免疫印迹

样品缓冲 液
电极缓冲 液
62.5 mM Tris-HCI, pH 6.8, 2% SDS, 25% 甘油,0.01% 溴酚蓝
25 mM Tris, 192 mM 甘氨酸, 0.1% SDS, pH 8.3
15％
10～43
C％=1:29
非变性体系
积层胶
分离胶
样品缓冲 液 电极缓冲 液
1×配方
4％ A/B, 0.125M Tris-HCl, pH 6.8, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED T％ A/B, 0.625M Tris-HCl, pH 8.8, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED 62.5 mM Tris-HCI, pH 6.8, 40% 甘油, 0.01% 溴酚蓝
变性蛋白
Native Sample Buff.(161-0738 30ml)
62.5mM Tris-HCl, pH 6.8, 40% Glycerol, 0.01%
Bromophenol blue
非变性蛋白
Tricine Sample Buff.(161-0739 30ml)
200mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 40% Glycerol, 0.04%
200ml 5-250mg/ml --15min 650-750nm Lowry et al. (1951)
Detergent
Reducer &. Detergent
Protein Assay
RC DC™ Protein Assay
• Reducing agent compatible • Detergent compatible
25 mM Tris, 192 mM甘氨酸, pH 8.3
变性体系
1×配方
积层胶
4％ A/B, 0.125M Tris-HCl pH 6.8, 0. 1% SDS, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED
分离胶
T％ A/B, 0.625M Tris-HCl pH 8.8, 0. 1% SDS, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED
基质及交联剂
•
T%＝
丙稀酰胺(g)＋交联剂(g 溶液总体积(ml)
)
100%
•
交联剂（ g）
C%＝丙稀酰胺（ g）＋交联剂（
g）100％
• 蛋白SDS-PAGE常用C％：1：29，1：37.5
Байду номын сангаас
• T%的线性分离范围：
T％
线性分离范围
5％
57～212
7.5％
36～94
10％
20～80
12％
12～60
样品制备——定量
Bio-Rad 蛋白测定方法特点 Quick StartTM Bradford 蛋白测定
标准浓度测定
样品体积
100ml
线性范围
0.125-1.5mg/ml
低浓度测定
样品体积
1ml
线性范围
1.25-25mg/ml
微孔板测定样品体积 ml
温浴时间
5min
测定波长 方法来源
595nm Bradford (1976)
SmartSpec plus™ Spectrophotometer
• 200–800 nm • Scanning mode • Standard curves • Kinetics • Direct display • Printer
电泳
基质及交联剂
基质： 交联剂：
丙稀酰胺（Acrylamide）
结合抗体 发光（显色）
信号检测
样品制备
• 细胞裂解 • 蛋白溶解（可一步完成） • 蛋白定量
样品制备——缓冲液
Laemmli Sample Buff.(161-0737 30ml)
62.5mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 5% b-ME, 25%Glycerol,
0.01% Bromophenol blue
Coomassie blue
多肽
检测磷酸化蛋白：再加入Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM
35mm小盘：250ml 30mm中盘：500ml100mm大盘：1ml
蛋白的定量
• 用于蛋白的快速定量方法主要有A280法、Bradford法、 Lowry 法三种方法，其中A280法灵敏度为0.2-2 mg/ml，但 核酸可引起强干扰作用；Lowry 法灵敏度为5-100 μg/ml， 虽相对准确，但干扰物质多且反应速度慢，而且含DTT溶 液不宜用此法；Bradford法灵敏度为25-200 μg /ml，由于 相对干扰物质较少，且反应时间仅需2分钟,故适合用于大 多数研究的蛋白定量。
• Bio-rad另有对一种适用于去垢剂增溶蛋白样品的比色测定 的试剂盒DC Protein Assay Kit，该方法类似于常规的 Lowry方法，但经过改良后，节省了操作时间。DC蛋白测 定只需要15分钟的温育时间，而且吸收值读数保持2小时的 稳定。RC DC Protein Assay Kit蛋白测定是一种适用于含 还原剂和去垢剂的蛋白测定，具有原来DC蛋白测定的特点， 并能与更多的试剂兼容，简化了复杂蛋白样品溶液的定量 测定。
印记法
Northern Blot
RNA
Western Blot Far Western
Blot Dot Blot
Protein
DNA
Southern Blot
Western-blot
• 高灵敏度、高特异性的蛋白检 测
• 应用于绝大多数生物、医学实 验室
• 成熟的技术、丰富的方案选择
主要步骤
样品制备 电泳 转膜 封闭
如何做好Western-blot（免疫印迹） --------随意谈
印记法
• 印迹（blotting）是指将样品转移到 固相载体上，而后利用探测物特异 性检测未知样品的方法。
• 1975年，Southern将DNA转印到硝 酸纤维素（NC）膜上，并利用 DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段， 后来称这种方法为Southern印迹法。
Bio-Rad 蛋白测定
100ml 0.2-1.5mg/ml
800ml 1.25-25mg/ml ml 5min 595nm Bradford (1976)
特殊的兼容物
--
--
DCTM 蛋白测定
RC DCTM 蛋白测定
100ml 0.2-1.5mg/ml
100ml 0.2-1.5mg/ml
200ml 5-250mg/ml ml 15min 650-750nm Lowry et al. (1951)