白血病分子生物学

TEL-AML1
由于12p和21q末端在常规显带中很相似，
因此常规细胞遗传学方法检出率仅0.05%， 需应用FISH或RT-PCR方法提高检测阳 性率 TEL基因重排是独立预后因素，RT-PCR 检测TEL-AML1融合基因能将低危险度 与高危险度的ALL患者区分开来。因此 早期检测TEL-AML1融合基因对临床预 后，确定合适的治疗方案都有重要意义
白血病的分子机制
白血病的分子机制
增殖过度
分化阻断 凋亡受抑
“二次打击”学说
D.Gary Gilliland Best Practice & Research Clinical Haematology.2003;16:409-417
白血病的分子检测
Southern blot
Northern blot Western blot
白血病的分子检测
RQ-PCR方法优点：
灵敏而特异 起点定量 闭管化学（污染的风险低） 没有PCR后处理（无需走胶，拍照等） 高度自动化 定性：单数据点测定 定量：多数据点测定 能做基因分型及SNP鉴定
RQ-PCR的操作流程
从细胞或组织中抽提DNA或RNA
用PCR或RT-PCR扩增特异片段
将PCR产物克隆到合适的载体上
PML-RARα
APL累及的RARα基因及其伙伴基因结构示意图
PML-RARα
由于PML基因断裂点不同产生3种不同的
PML-RARα异构体 约55%的M3患者为L型，40%为S型， 5%为V型，且每位患者只表达一种PMLRARα融合蛋白 形态学上S型白血病细胞常为低分化的并 且这些患者可见继发细胞遗传学异常，V 型APL患者的白血病细胞体外对ATRA 的敏感度低
白血病分子生物学
孙晓琳 爱普益医学检验中心
白血病分子生物学
白血病的分子机制
白血病的分子检测 白血病分子检测的临床应用
白血病的分子机制
基因(gene)：合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所 必需的全部核酸序列。 癌基因(oncogene)：细胞或病毒中存在的，能诱导 正常细胞转化并使之获得新生物特征的基因。 癌基因活化的方式： 点突变 染色体重排 基因扩增 抑癌基因(tumor suppressor genes)：指一类基因， 其产物对细胞生长增殖起负调控的作用，并能潜在抑 制细胞的恶变。
FLT3基因突变
FLT3基因突变
FLT3基因主要突变类型
FLT3基因突变
mut-FLT3信号通路
FLT3基因突变
外周血白细胞计数
APL患者初发时外周血WBC计数 (x10 9)
160 140 120 100 80 60 40 20 0 FLT3-ITDFLT3-ITD+
CBFβ-MYH11
FISH
PCR
测序
芯片
白血病的分子检测
PCR反应原理
白血病的分子检测
PCR理论方程
N = N0 x (1+E)n
N：扩增子数量 N0：起始模板数量 E：扩增效率 n：循环数
白血病的分子检测
PCR方法优点
快速 灵敏 特异 PCR方法缺点 假阳性 假阴性
白血病的分子检测
AML1-ETO
对初发患者进行t(8;21)和AML1-ETO融
合基因的检测对其预后判断及治疗方案 的制定相当重要 AML1-ETO定性结果不能用于评价患者 MRD情况 RQ-PCR能实时反映体内AML1-ETO水 平。连续定量AML1-ETO转录本水平可 判定有高复发风险的患者，以便及早治 疗干预以防血液学复发
WT-1基因高表达
Wilms tumor 1
是无特异分子异常的急性白血病患者理
想的MRD检测指标 伴此基因高表达者预后差，且表达程度 与预后相关
BCR-ABL
t(9;22)(q34;q11) 15~30%成人ALL及3~5%儿童ALL 9号染色体的断裂点与CML相同，但22号染色
体外转录成RNA片段（仅用于RNA样品）
纯化，定量和系列稀释质粒DNA或RNA 构建标准曲线（CT υ lgcopy） 样品的定量检测 校正样品基因拷贝数
白血病分子检测的临床应用
白血病的分子生物学检查对白血病诊断分 型及预后判断有以下几方面意义： 补充MIC检查的不足 发现新的亚型 监测白血病的微小残留病灶（MRD） 为研究白血病的发病机制打下基础
•无法多重检测 •无模板特异性 •灵敏度低
白血病的分子检测
CT值：荧光信号有统计学意义显著增长
（穿过阈值线）时的循环次数 CT值与起始模板量成反比
白血病的分子检测
RQ-PCR的检测系统： 该系统内置了96孔PCR仪，且在每个反应孔上 均有一个监测探头用于检测PCR反应管中的荧 光强度。平均每8-12秒就检测一次，以达到实 时检测的目的。 系统中的电脑系统同时不断地分析来自检测系 统的信息，不断计算每个反应管中的荧光强度， 并最终得到CT值。 该系统可以根据标准品的CT值和拷贝数自动绘 制标准曲线，并计算未知样品中的目的基因拷 贝数。
PCR：仅适用于染色体断裂点丛集于相对小 的范围内（<2kb），如T-ALL中SIL-TAL1。
RT-PCR：可用于染色体断裂点跨越很大的 区域的融合基因。 巢式RT-PCR：可显著提高反应的特异性， 增加扩增效率。 RQ-PCR：可定量扩增产物。
白血病的分子检测
RQ-PCR（Real-time Quantitative PCR）
TEL-AML1
t(12;21)(p13;q22) 25%儿童ALL，是儿童ALL中最常见的分子异
常 目前为止尚未在T-ALL，AML或NHL中发现 t(12;21)，在婴儿白血病中极少报道，在成人 白血病患者中频率很低（<2%） 此类患者发病年龄小（2岁~10岁），WBC计 数低（<50 000/L），免疫表型为前B-ALL 此类患者对治疗反应佳，完全缓解时间长，预 后好
inv(16)(p13;q22)及t(16;16)(p13;q22)
主要见于M4Eo，10%不伴异常嗜酸细胞
M4，少见于M2 CBFβ-MYH11融合蛋白通过干扰核心结 合因子（core binding factor,CBF）的 转录激活作用而致病 具有CBFβ-MYH11的患者对化疗敏感， 预后较好，故提高检测率尤具临床意义
C-KIT基因突变
C-KIT基因结构
JM
C-KIT基因突变
外周血白细胞计数
C-KIT基因突变
生存曲线
PML-RARα
t(15;17)(q22;q21) 98%M3患者 继t(15;17)之后，又先后发现4种M3特异的累及
RARα的变异性染色体易位：t(11;17)(q23;q21)， t(5;17)(q35;q21)，t(11;17)(q13;q21)以及 dup(17)(q21.3;q23)，分别产生PLZF-RARα， NPM-RARα，NuMA-RARα和STAT5b-RARα融 合基因 临床上，具有PLZF-RARα或STAT5b-RARα融 合基因患者对ATRA治疗不敏感，其余三种染 色体易位患者经ATRA治疗可获完全缓解
DEK-CAN
t(6;9)(p23;q34) 主要见于M2或M4，也见于M1，MDS-RAEB 伴DEK-CAN的患者年龄一般较轻，且预后较
差 此类患者进行分子监测有助于判断患者预后， 调整治疗方案
N-RAS基因突变
为RAS基因家族成员之一，染色体定位于
1p32.2。具有GTP/GDP结合和GTPase活性， 调控正常细胞的生长 此基因突变存在于11-30%AML 突变热点位于codon12,13和61 在inv(16)/t(16;16),inv(3)/t(3;3)中突变率较高， 而在t(15;17)中低 伴此突变患者外周血WBC计数低 该突变预后意义尚不明
L+
阴性 S+
FLT3基因突变
Fms-related tyrosine kinase 3 FLT3为III型受体酪氨酸激酶家族（还包括c-
FMS，PDGFRβ和c-KIT）成员之一，该类受 体因在造血过程中造血细胞的增殖和存活中发 挥重要调控作用 综合国外各研究报道， FLT3-ITD和D835突变 在AML中阳性率分别为24%(385/1585)和 7%(30/429)，总阳性率超过30%，使其成为 AML中最普遍发生突变的靶基因 许多临床研究发现，FLT3突变还与临床预后 密切相关，尤对60岁以下的AML患者，FLT3 突变患者预后较差，且可独立于核型之外
AML1- 阴性 ETO+
C-KIT基因突变
C-KIT为III型受体酪氨酸激酶家族（还包括c-
FMS，PDGFRβ和c-KIT）成员之一 AML1-ETO可诱导性表达的转基因小鼠，并不 导致白血病发生 C-KIT突变可见于伴inv(16)的M4以及伴t(8;21) 的M2患者 26/54例(48.1%) M2b患者中检测到C-KIT基因 突变 57例不伴t(8;21)的其他类型血液肿瘤患者均未 检测到C-KIT基因突变 以上结果提示C-KIT突变与M2b密切相关 (R=0.94, P<0.01)
CBFβ-MYH11
CBFβ-MYH11具有多种变异型，其中最
常见的为A型，占80% RT-PCR检测CBFβ-MYH11进行MRD监 测显示，大部分患者在完全缓解时PCR 转阴，但仍有小部分长期存活者PCR仍 为阳性 最新研究采用RQ-PCR检测CBFβMYH11转录本水平来评价M4Eo患者 MRD情况，预示复发
白血病分子检测的临床应用
PCR方法检测MRD常用的分子标志
AML1-ETO
t(8;21)(q22;q22) 6~8%原发性AML，在M2中的阳性率为
20~40%，在M2b中阳性率为90% 少见于M4和M1，极少见于MDS和骨髓增生综 合症 AML1-ETO+白血病细胞有一定程度的分化能 力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性 粒细胞，且对化疗反应较敏感 AML1-ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果 好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后 较其他AML亚型（M3除外）好
PML-百度文库ARα
RT-PCR检测PML-RARα是敏感且特异的
APL诊断方法，还能用于治疗后MRD监 测。PML-RARα阳性提示的分子复发常 早于临床复发3-6个月，为临床采取进一 步治疗措施提供了保障 RQ-PCR能有效反映患者在发病、治疗、 缓解、复发整个过程的白血病细胞负荷， 在MRD监测中比RT-PCR具有更高价值
体断裂点具有异质性 此融合蛋白p190刺激细胞增殖的能力比p210要 强。在转基因试验中观察到p190诱发的白血病 具有起病早、发展快和恶性程度高的特点 BCR-ABL+ALL患者预后差，5年存活率<20%， 因此这些患者在缓解后需进行骨髓移植治疗
BCR-ABL
对于自体或异体移植ALL患者，移植前
NPM基因突变
Nucleophosmin，为核-浆穿梭蛋白，调控p53-
ARF通路 见于~50%核型正常的AML患者，而在伴低危/ 高危核型患者中极少见 主要见于M4/M5中 第12号外显子的插入/缺失 伴此突变患者WBC计数高 目前，此突变的预后价值各研究组报道不一， 尚待进一步证实
荧光标记扩增产物 荧光标记引物 特异性荧光标记探针 TaqMan探针、分子信标、杂交双探针 荧光染料直接结合扩增产物 SYBR Green I与DNA双链结合 动态监测荧光信号变化
TaqMan探针法
•特异性高 •多重基因定量 •成本较高
SYBR Green I 法
•成本低 •最适合初步筛查
•熔解曲线功能
后BCR-ABL的有无以及BCR-ABL的转录 本类型与预后有关
e1a2+ 阴性
E2A-PBX1
t(1;19)(q23;p13) 5~6%儿童ALL和3%成人ALL 此类患者具有高的白细胞计数，高的血清乳酸
脱氢酶及中枢神经系统症状，预后差，平均无 病生存期（DFS）仅6个月，3年DFS为20%， 需给予这些患者强化治疗才能获得较好的预后 核型和E2A-PBX1检测对此类患者的诊断和治 疗方案的选择至关重要 E2A-PBX1的预后价值需更多的临床研究证实