生物制品 第三章生物制品课件

最常用是白油司本佐剂 方法：制备油相：94%杭州10号白油，加6% 司本80（HLB，亲水亲油值，值高亲水强，值 低亲油强），HLB是4、2，混合后加2%硬质 酸铝，熬化溶解，高压灭菌备用。 水相：疫苗加4%吐温80（HLB 15）搅 拌均匀即成。按油：水，3—1：1进行高速搅 拌或胶体磨磨3遍就成。如果搅拌油中慢慢加 入水相，制成是油包水，W/O，反之是水包油， O/W。





B、矿物油司本佐剂（现在经常用的，以后专 讲） 3、免疫刺激复合物佐剂—简写ISCOM佐剂 （皂苷类）。 4、蜂胶佐剂 5、脂质体佐剂 其它佐剂—MF59，微胶囊佐剂。
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（二）非颗粒佐剂 肽类佐剂：胞壁酰二肽（结核杆菌细胞壁）， 脂肽及免疫调节多肽。 表面活性剂：海藻糖合成的衍生物。 核酸类：合成核苷酸聚合体，次黄嘌呤衍生 物，免疫刺激序列DNA。

（五）时间：灭活时间与温度和浓度成反比， 即灭活杀菌 长，温度旧低，浓度也 低，就可 以杀灭细菌。
（六）pH：碱性快，酸性慢，酸性环境对 抗 原保护好。


（七）有机物存在：环境的 有机物减低灭活 的效果，微生物也是有机物。
四、灭活疫苗时的注意事项
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2人参加灭活，注意药品名和量，灭活后标记。
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二、常用的灭活剂种类和原理

（一）甲醛：是最古老常用的灭活剂，现在我 国用的26种灭活疫苗，均以甲醛为灭活剂。
性质：甲醛为刺鼻的气体，水溶液叫福尔 马林，浓度为36%-40%。10°C以下易聚合成 三聚甲醛或多聚甲醛，为白色沉淀。


原理：甲醛的醛基起灭活作用，可使
蛋白质的氨基→羟甲基胺 羧基→亚甲基二醇单酯 羟基→羟甲基酚 巯基→硫代亚甲基二醇


1、氢氧化铝胶 合成方法：有三种，铝粉加烧碱；明矾加碳酸 钠以及明矾加氨水等。 明矾加氨水方法：20%澄清的明矾水，温度60 度，边搅边加氨水，到pH8时停止，然后打磨 均匀，清水漂洗多次硫酸根离子，到pH7时既 可，装瓶高压灭菌，用时20%加入疫苗。

2、明矾：有钾明矾和胺明矾，主要是吸附、沉淀、 浓缩作用；精致10%明矾水，灭菌，25度保存， 按疫苗量1—2%加入，摇匀即可，有沉淀作用。 主要用于破伤风类毒素的沉淀和气肿疽灭活疫苗 的使用。 3、磷酸三钙佐剂，与铝胶同样作用，制作简便。




按化学性质分类： 复合物：脱脂牛奶，血清。 糖类：蔗糖、乳糖。 盐类：乳酸钙、谷氨酸钠。 醇类：甘油，山梨醇，甘露醇。 酸类：柠檬酸，氨基酸。 聚合物：葡聚糖，聚乙烯吡咯酮。
一、冻干保护剂的组成和作用




按组成将保护剂分为营养液，赋形剂，抗氧化 剂。 营养液：使受损细胞修复：脱脂牛奶，蛋白质， 氨基酸，糖类。 赋形剂：骨架作用，制品形成网孔结构，易溶 解----蔗糖，乳糖。 抗氧化剂：保护酶类，防止氧化—VC，VE， 硫代硫酸钠。
保护剂的作用：
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防止细胞内水结晶和细胞失去水分。 平衡细胞内外渗透压，防止细胞破裂。 助于细胞修复以及冻干后复苏。
二、影响保护剂效果的因素
判断保护剂的好坏，从冻干后的存活率，以及生 物制品的保质期研究。然后对不同物质筛选不同 配方，选出好的保护剂。 1、保护剂的种类：不同微生物用不同的保护剂。 2、保护剂的浓度：5—10%的葡萄糖保存大肠 杆菌存活率高。 3、保护剂配制方法：糖、血清、维生素不能高 温灭菌，糖可以114°C30分钟灭菌，其他可以过 滤除菌。 4、保护剂的pH：一般为6-8。
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(二)几种常用的保护剂
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5%蔗糖脱脂牛奶—新城疫疫苗 明胶蔗糖保护剂---禽霍乱疫苗 聚乙烯吡咯酮乳糖—厌氧菌 SPGA（蔗糖76、62g，磷酸二氢钾0、52g， 磷酸氢二钾1、62g，谷氨酸钠0、83g，牛 血清蛋白10g，去离子水1000ml）鸡马立克 氏疫苗。




（五）β—丙酰内酯 良好病毒灭活剂，性状 是无色有气味液体，易潮解和高温失效， 5°C密封保存好，现主要用于狂犬灭活苗。
另还有防治细菌霉菌生长的防腐剂：硫柳汞 （乙基汞硫代水杨酸钠），叠氮钠（NaN3）


它们使用浓度0、01-0、02%。可防止血清腐 败。
三、影响灭活作用的因素

（一）药物的特异性：酚类不能杀灭真菌和病 毒，阳离子的结晶紫，主要作用于G+菌。
（三）苯酚（石碳酸）人类用的 第一个消毒 药，具有特殊气味的无色结晶，易潮解成水溶 液，与光、氧后颜色变紫色。 原理：蛋白质变性以及抑制氧化脱氢酶，芽孢 和病毒对它抵抗力强。 灭活浓度：抑菌作用是0、2—0、5%（血清防 腐），杀菌是1%，杀葡萄球菌是3%。 消毒常用它的衍生物，来苏儿（甲酚皂）3— 5%浓度，特殊气味，覆盖其他气味，也是医 院常用的。




（二）佐剂具备的条件 1、安全无毒副作用。 2、无致癌性。 3、纯度高，吸附力强，易吸收。 4、不含与动物交叉免疫的抗原物质。 5、不引起机体对自身超敏性。 6、耐储存，1年以上，不变质。
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（三）作用机理： 抗原递程—助于吞噬细胞的吞噬和抗原传递。 引起细胞浸润。 抗原寻找—增加抗原目标，改变抗原构型， 吸引吞噬细胞；延长体内储存。 免疫调节—增强免疫应答，包括细胞免疫和 体液免疫。



三、常用的保护剂

生物制品保护剂很多，各国家不同，如鸡新城 疫苗（ND），我国是5%蔗糖脱脂牛奶；日本 是5%乳糖、0、15%聚乙烯吡咯酮、1%马血 清。
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(一)不同微生物用不同保护剂 细菌疫苗：10%蔗糖；5%蔗糖脱脂牛奶； 5%蔗糖、1、5%明胶；10-20%脱脂牛奶。 厌氧菌苗：0、1%谷氨酸钠、10%乳糖； 10%脱脂牛奶；7、5%葡萄糖血清。 病毒疫苗：多用混合保护剂，如5%蔗糖脱 脂牛奶。

将灭菌的20%氯化钙2、5ml加入100ml疫苗中摇 匀，再加入20%磷酸氢二钠7、5ml，摇匀即成白 色絮状沉淀。加的次序不能错，该佐剂沉淀作用 比铝胶强。


（二）油类佐剂（矿物油司本佐剂） 乳化剂是一种降低其它溶液表面张力作用的物 质，可使一种物质分散混合于另一不相容的液 体中。司本80或吐温80既是乳化剂。他们可使 油类和水剂疫苗乳化均匀。 疫苗水剂是分散相（内相）,油类为连续相 （外相），两者中间是乳化剂，可以做成油包 水，W/O；也可以做成水包油，O/W;前者不 易吸收，储存时间长。后者容易吸收和释放。
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37°C灭活一天后，接种适宜培养基—无菌检查。
动物试验，灭活苗制成后，注射小白鼠0、2ml，
两只，观察3天。
4.
使用试验：用户可先注射1-2头，观察1—2天， 看有无过敏，应激等反应，证明安全，才全群使 用。

思考题：
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什么叫灭活和灭火剂？ 灭活剂的种类有哪些？ 影响灭活的因素是什么？ 灭活的注意事项有哪些？



(Joseph Lister,1827~1912) 首创用石炭酸喷洒手术室 和煮沸手术用具以防术后 感染，为防腐、消毒，以 及无菌操作奠定了基础。

（四）结晶紫（龙胆紫），也叫紫药水，碱性 染料，也叫甲紫或甲基青莲，化学名，六甲基 副玫瑰苯胺。
原理：碱性阳离子可结合细菌阴离子羧基；干 扰细胞壁粘肽合成；常作用于革兰氏阳性菌。 生物制品的应用有猪瘟结晶紫疫苗，鸡白痢染 色抗原。
第三章 灭活剂、保护剂、 与免疫增强剂
第一节 灭活剂 一、灭活与灭活剂

（一）灭活：杀死病原微生物，但不影响免疫原性； 其次是破坏血清的补体，以免干扰血清学反应结果。 灭活剂：灭活微生物的化学试剂。 灭活方法：物理灭活：加热、超声波及射线灭活微 生物，此方法免疫原性易破坏，现很少使用（血清 56°C半小时灭活补体用此方法）。 化学灭活：用化学试剂将病原微生物杀 死，此方法经常使用。
第二节 保护剂

保护剂也叫稳定剂，是防止微生物在冻干过程 中受到破坏。 按作用原理分两类： 渗透剂：能渗入细胞，使胞内外渗透压平衡， 防止慢冻时损伤细胞。有甘油，蔗糖，二甲基 亚砜。


非渗透剂：防止细胞内外物质交换在速冻时保 护细胞。有 蛋白质，聚乙烯吡咯酮。

按保护剂分子量分类： 低分子量保护剂：糖、氨基酸类。 高分子量保护剂：脱脂牛奶、明胶。


此类常用于病毒灭活，种类有AEI—N-乙酰乙烯亚胺， 加入浓度到0、05%。
BEI—二乙烯亚胺，浓度0、02%；EEI—2—乙基乙 烯亚胺，GDA—缩水甘油醛。 灭活后加硫代硫酸钠可终止灭活，防止抗原损失。


保存：AEI，0--4°C一年，--20°C二年；BEI 0-4°C保存一个月。



思考题： 什么叫保护剂？组成和作用是什么？ 影响保护剂效果的因素有哪些？ 常用保护剂有哪些？
第三节 免疫佐剂

一、佐剂的概念和原理： （一）概念：adjuvant一词来源于拉丁语，即 辅佐之意。免疫佐剂是一种非特异免疫增强剂，
先注射或和抗原同时注射，能明显增强免疫反 应。最新概念：凡是增强抗原特异性免疫反应 的物质，均叫佐剂。

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佐剂的分类： 按物理性质：颗粒型佐剂，非颗粒佐剂。 按生物学性质：微生物和非微生物佐剂。 按存储时间：储存型和非存储型。

（一）颗粒型佐剂—将抗原包括成颗粒状。
1、盐类佐剂—氢氧化铝胶，明矾，磷酸三钙 等。
2、油类佐剂 A、弗氏佐剂：1935年，美籍匈牙利学者 Freund发明，分弗氏不完全佐剂：矿物油7585%+加羊毛脂（乳化剂）15—25%，充分乳 化即成，简写FIA,Freunds incomplete advuant；弗氏完全佐剂：是在FIA中加入死结 核杆菌或卡介苗即成，缩写FCA.。
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含硫复合物：左旋咪唑（既可驱虫，又可免 疫增强）。 高分子碳水化合物，香菇多糖。 细胞因子：IL—1、2、4；干扰素，转移因子 等。 其它，霍乱毒素，类毒素。
三、常规免疫佐剂


（一）盐类佐剂 1926年Gleny使用铝胶佐剂，几十年来， 人畜疫苗已经广泛使用该佐剂。 作用机理：a，储存和延缓吸收；b、增加 抗原表面积；c、形成巨噬细胞肉芽肿（增强 体液和细胞免疫）。
(三)保护剂的添加：一般是疫苗和保护剂1：1 加入（5%蔗糖脱脂牛奶—新城疫疫苗），还 有是按疫苗量加入保护剂到规定浓度（如5% 蔗糖明胶保护剂，加疫苗是先配浓度高的40% 的蔗糖、12%明胶，然后按疫苗7份，保护剂1 份混合。）。 弱毒疫苗饮水：加0、2%奶粉，以中和水中的 有害离子和毒性物质。


（二）微生物的种类和特异性：G+菌和G-菌 对药物敏感不一样，繁殖体和芽孢对药物敏感 也不一样。
（三）药物浓度：浓度愈大，灭活越快，抗原 也损失大；但是，95%酒精没75%酒精杀灭细 菌好。


（四）温度：温度与灭活成正比，每升高10度， 金属类杀菌作用增加2—5倍。但高温超过 40°C，抗原也损失大。


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油乳疫苗检验： 1、粘度检测：口径Ф1、2mm吸管，吸1ml乳 剂，放出0、4ml的时间在2—6秒为宜，不可 多于10—15秒，注射困难。 2、稳定性检查：①加速老化试验，37度， 10—30天，不破乳；②离心3000转/分钟，15 分钟不分层，可以保存一年。
（三）蜂胶佐剂


1、蜂胶的理化特性：蜂胶含树脂、蜂分泌物， 蜂蜡、花粉及其它多种物质，为固体粘稠状， 冷硬热软，灰褐色，20-40度发粘，15度下变 硬脆，60-70度液化。 等级：乙醇溶解后测含量，含66-70%为一级； 61-65%为二级；56-60%三级；50-55%是四 级。方法：2、5克蜂胶，加乙醇25ml冷浸24h， 滤纸过滤，45度干燥，计算浸出物的含量。

浓度：需氧菌甲醛浓度到0、1%--0、2%.
厌氧菌0、4%--0、8%. 病毒0、05%--0、4%. 原则是浓度低，时间短，温度低可以灭 活细菌，尽量减少破坏抗原（通常加入量，以 甲醛含量量计算，折合福尔马林浓度）。

（二）烷化剂：将烷基引入，形成烷基取代物，使微 生物变性死亡。 原理：主要破坏病毒的核酸，作用于A：G碱基，引 起DNA单链断裂或双链铰连。