糖类与蛋白质的分析方法

糖类与蛋白质的分析方法

实验一、糖的呈色反应和定性鉴定

目的要求

(1) 学习鉴定糖类及区分酮糖和醛糖的方法。

(2) 了解鉴定还原糖的方法及其原理。

Ⅰ. Molish反应——α-萘酚反应

实验原理

糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物与α-萘酚作用形成紫红色复合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称紫环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸以及丙酮、甲酸和乳酸均呈颜色近似的阳性反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。

试剂

Molish试剂：取5g α-萘酚用95%乙醇溶解至100mL，临用前配制，棕色瓶保存。

1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。

操作方法

取试管，编号，分别加入各待测糖溶液1 mL，然后加两滴Molish试剂，摇匀。倾斜试管，沿管壁小心加入约1mL浓硫酸，切勿摇动，小心竖直后仔细观察两层液面交界处的颜色变化。用水代替糖溶液，重复一遍，观察结果。

Ⅱ. 蒽酮反应

实验原理

糖经浓酸作用后生成的糠醛及其衍生物与蒽酮（10-酮-9，10-二氢蒽）作用生成蓝绿色复合物。

试剂

蒽酮试剂：取0.2g 蒽酮溶于100mL 浓硫酸中，当日配制。

待测糖溶液，同Molish试验。

操作方法

取试管，编号，均加入1mL蒽酮溶液，再向各管滴加2 ~ 3滴待测糖溶液，充分混匀，观察各管颜色变化并记录。

Ⅲ. 酮糖的Seliwanoff反应

实验原理

该反应是鉴定酮糖的特殊反应。酮糖在酸的作用下较醛糖更易生成羟甲基糠醛。后者与间苯二酚作用生成鲜红色复合物，反应仅需20-30秒。醛糖在浓度较高时或长时间煮沸，才产生微弱的阳性反应。

试剂

Sediwanoff试剂：0.5g 间苯二酚溶于1升盐酸（H2O∶HCl=2∶1）(V/V)中，临用前配制。1%葡萄糖；1%蔗糖；1%果糖。

操作方法

取试管，编号，各加入Sediwanoff试剂1mL，再依次分别加入待测糖溶液各4滴，混匀，同时放入沸水浴中，比较各管颜色的变化过程。

Ⅳ. Fehling试验

实验原理

费林试剂是含有硫酸铜和酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。硫酸铜与碱溶液混合加热，则生成黑色的氧化铜沉淀。若同时有还原糖存在，则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。

为防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀，Fehlin试剂中加入酒石酸钾钠，它与Cu2＋形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子，该反应是可逆的。平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜。费林试剂是一种弱的氧化剂，它不于酮和芳香醛发生反应。

试剂

试剂甲：称取34.5g硫酸铜溶于500mL蒸馏水中。

试剂乙：称取125g NaOH 137g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。临用前，将试剂甲和试剂乙等量混合。

1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。

操作方法

取试管，编号，各加入Fehlin试剂甲和乙1mL。摇匀后，分别加入4滴待测糖溶液，置沸水浴中加热2 ~ 3min，取出冷却，观察沉淀和颜色变化。

Ⅴ. Benedict试验

实验原理

Benedict试剂是Fehling试剂的改良。Benedict试剂利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂，其碱性较Fehling试剂弱，灵敏度高，干扰因素少。

试剂

Benedict试剂：将170g 柠檬酸钠和100g 无水碳酸钠溶于800mL水中；另将17g硫酸铜溶于100mL热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅，最后定容至1000mL。该试剂可长期使用。

1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。

操作方法

取试管，编号，分别加入2mL Benedict试剂和4滴待测糖溶液，沸水浴中加热5分钟，取出后冷却，观察各管中的颜色变化。

Ⅵ. Barfoed试验

实验原理

在酸性溶液中，单糖和还原二糖的还原速度有明显差异。Barfoed试剂为弱酸性。单糖在Barfoed试剂的作用下能将Cu2+还原成砖红色的氧化亚铜，时间约为3分钟，而还原二糖则需20分钟左右。所以，该反应可用于区别单糖和还原二糖。当加热时间过长，非还原性二糖经水解后也能呈现阳性反应。

试剂

Barfoed试剂：16.7g 乙酸铜溶于近200mL水中，加1.5mL冰醋酸，定容至250mL即可。1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。

操作方法

取试管，编号，分别加入2mL Barfoed试剂和2 ~ 3滴待测糖溶液，煮沸2-3分钟，放置20分钟以上，比较各管的颜色变化。

注意事项

（1）Molish反应非常灵敏，0.001％葡萄糖和0.0001％蔗糖即能呈现阳性反应。因此，不可在样品中混入纸屑等杂物。当果糖浓度过高时，由于浓硫酸对它的焦化作用，将呈现红色及褐色而不呈紫色，需稀释后再做。

（2）果糖与Seliwanoff试剂反应非常迅速，呈鲜红色，而葡萄糖所需时间较长，且只能产生黄色至淡黄色。戊糖亦与Seliwanoff试剂反应，戊糖经酸脱水生成糠醛，与间苯二酚缩合，生成绿色至蓝色产物。

（3）酮基本身没有还原性，只有在变成烯醇式后，才显示还原作用。

（4）糖的还原作用生成氧化亚铜沉淀的颜色决定于颗粒的大小，Cu2O颗粒的大小又决定于反应速度。反应速度快时，生成的Cu2O颗粒较小，呈黄绿色；反应速度慢时，生成的Cu2O颗粒较大，呈红色。溶液中还原糖的浓度可以从生成沉淀的多少来估计，而不能依据沉淀的颜色来判断。

（5）Barfoed 反应产生的Cu2O沉淀聚集在试管底部，溶液仍为深蓝色。应注意观察试管底部红色的出现。

思考题

1. 列表总结和比较本实验六种颜色反应的原理和应用。

2. 运用本实验的方法，设计一个鉴定未知糖的方案。

实验二、总糖和还原糖的测定（一）

──费林试剂热滴定法

目的要求

掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用直接滴定法测定还原糖的方法。

实验原理

还原糖是指含有自由醛基（如葡萄糖）或酮基（如果糖）的单糖和某些二糖（如乳糖和麦芽糖）。在碱性溶液中，还原糖能将Cu2+、Hg2+、Fe3+、Ag+等金属离子还原，而糖本身被氧化成糖酸及其他产物。糖类的这种性质常被用于糖的定性和定量测定。

本实验采用费林试剂热滴定法。费林试剂由甲、乙两种溶液组成。甲液含硫酸铜和亚甲基蓝（氧化还原指示剂）；乙液含氢氧化钠，酒石酸钾钠和亚铁氰化钾。将一定量的甲液和乙液等体积混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀：2NaOH + CuSO4 = Cu(OH)2+ Na2SO4在碱性溶液中，所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钠反应，生成可溶性的络合物酒石酸钾钠铜：

在加热条件下，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，酒石酸钾钠铜被还原糖还原，产生红色氧化亚铜沉淀，其反应如下：

反应生成的氧化亚铜沉淀与费林试剂中的亚铁氰化钾（黄血盐）反应生成可溶性复盐，便于观察滴定终点。Cu2O + K4Fe(CN)6 + H2O Cu2O + K4Fe(CN)6 +