上海海洋大学基因工程实验指导

《基因工程实验》讲义

水产与生命学院

2011年12月

目录

注意事项 (2)

实验一中华绒螯蟹肌肉中基因组DNA提取 (3)

实验二动物组织总RNA的提取 (5)

实验三cDNA第一条链的合成 (7)

实验四重组DNA的制备 (8)

（1）利用PCR技术获得DNA片段以及PCR产物的纯化 (8)

（2）纯化产物连接入T载体并将其转化感受态细胞DH5 (10)

（3）碱变性法提取质粒DNA（小规模）并酶切鉴定 (11)

实验五利用RACE法克隆基因 (13)

注意事项

1.上实验课不能迟到，分小组进行实验。

2.课前要提前预习实验内容，弄清实验设计的原理，理清实验顺序。

3.由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，做好

统筹安排。

4.实验的每一步都要详细的记录操作内容、时间、步骤、结果等。

5.对任何自己不熟悉的实验仪器（尤其是移液器）都不要随意操作。

在操作过程中发现任何意外的现象都要及时向任课老师汇报。

6.在实验室内不能大声喧哗，，严格遵守课堂纪律。

7.在实验操作过程中注意一定要穿实验服，带手套，制造的任何垃

圾都要丢到垃圾筐里，严禁随地投弃。特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。

8.实验时损坏的任何物品都要及时申报。

9.实验结束后要把用过的器皿清洗干净并归放整齐、清点数目，向

老师汇报征得同意后方可离开实验室。

10.写作实验报告或实验论文一定要纹理通顺、逻辑清晰、图标说明

详细、讨论分析透彻（包括操作的失误）。

实验一中华绒螯蟹肌肉中基因组DNA提取

一、实验目的：掌握一种提取基因组DNA的方法。

二、实验原理：采用细胞裂解液裂解细胞，加入蛋白酶K除去蛋白，然后用氯仿抽提DNA，最后用RNA酶处理，获得基因组DNA

三、试验材料

1.实验器具：移液抢、灭菌枪头、离心管、恒温仪、高速离心机、研钵、研磨棒。

2.实验对象：中华绒螯蟹

3.试剂：氯仿、无水乙醇、TE。

四、方法步骤：

1.准备：25-30mg中华绒螯蟹肌肉在液氮中研碎，将粉末收集到1.5ml离心管中，用200

μlTE悬浮。注意避免多次冻融样品，每次冻融都大大降低完整DNA的产率。

2.200μl样品加400μl cell lysis solution混匀，再加入6μl Proteinase K混匀，置于55℃

水浴5-10min。其间上下混匀几次，延长消化时间到30min可能效果更好。

3.加入600μl氯仿（自备）混匀，不能太剧烈，以保证DNA的完整性。

4.在台式离心机上，10000转/分，室温离心2min。此时应分成三层，基因组DNA在上层

中，如未能分层，表明样品与氯仿未混匀。取500μl上层清液，置于无菌1.5ml离心管中。

5.加入500μl Precipitation Solution混匀，室温放置2min。10000转/分，离心2min。

6.吸去上清，注意不要吸到沉淀，立即加入100μl，1.2mol/l NaCl,轻轻振荡直至DNA样

品完全溶解，加入3μl RNaseA，置于37℃5-10min，以除去RNA。

7.加入300μl冰冷乙醇（自备），-20℃放置10min。10000转/分，离心5-8min。吸走或倒

掉乙醇，用70%乙醇清洗一次。倒置室温干燥10min。DNA用100μl水或TE溶解。8.电泳检测

电泳：

一、试验目的：依据核酸的相对分子量分离核酸。通过已知大小的标准物移动的距离与未

知片段的移动距离进行比较，推测出未知片段的大小。

二、试验材料：电泳仪、琼脂糖、缓冲液、微波炉、胶板、做胶槽

三、试验步骤：

1.1%浓度的胶：称取0.15g的琼脂糖，加入15ml的0.5×TBE buffer。放入微波炉加热，

使琼脂糖完全溶解混匀。当胶溶液稍微冷却后，混匀后倒入做胶板中。三十分钟后取出。

2.点样：5μl的DNA样品和1μl的上样缓冲液混合后加入胶孔中。

3.电泳：100V，30min左右。

4.染色：将电泳后的琼脂糖凝胶放入含有EB的TBE中染色15分钟。

5.观察拍照。

注意事项：

1.液氮研磨时要充分、迅速。

2.吸取上层水相时切勿吸到中间层（蛋白）。

3.离心时将离心管对称放入离心机中，保持平衡。

实验二动物组织总RNA的提取

【实验目的】

1.掌握一种RNA提取的方法。

【实验原理】

TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中，当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机相主要为DNA和蛋白质。【实验药品与器材】

匀浆器，微量移液器，微量恒温器，1.5mL离心管，冷冻离心机，Trizol试剂，氯仿，异丙醇，75％酒精，DEPC水，琼脂糖，电泳仪，分光光度计。

【步骤】

取样：将罗氏沼虾活体解剖，迅速取卵巢组织约100mg于1.5ml的离心管中，置液氮罐冷冻备用。用Trizol试剂提取总RNA：

1.每个离心管加1mL Trizol试剂于冰上碾碎组织

2.碾碎后在30℃恒温箱中保存5分钟

3.每1mL Trizol加0.2mL氯仿，用手震荡15秒，放30℃恒温箱中3分钟

4.离心：低温4℃，12000g，15分钟

5.取上层水相到另一干净离心管

6.每1mL Trizol加0.5mL异丙醇，30℃恒温箱中10分钟

7.离心：低温4℃，12000g，10分钟

8.清洗RNA：移去上清，每1mL TRIzol加入1mL75%酒精，用移液枪反复吹洗打散

9.离心：低温4℃，7500g，5分钟

10.乙醇析出，可见白色沉淀于管壁，自然干燥15分钟

11.用30μL DEPC直至完全溶解，然后放置于-80℃冰箱保存。

12.1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量

13.测OD值