新型脂肪胺检测荧光衍生试剂的合成及应用

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脂肪胺因毒性大、反应活性高等特点而备受环境检测部门关注。脂肪胺易与亚硝基化合物反应，产生具有潜在致癌性作用的N-亚硝胺类化合物，并且脂肪胺很容易从土壤和水中迁移。在生态循环过程中，脂肪胺对人类的身体健康造成很大威胁。因此，对环境样品中脂肪胺的含量进行精确检测，并控制其在环境中的存量具有重要意义。

然而，准确检测环境样品中脂肪胺存在一定困难：1）一些脂肪胺会被降解和稀释，因此只能在痕量水平上实施检测；2）由于脂肪胺的分子结构无紫外辐射和荧光性，痕量的脂肪胺无法直接被检测到，除非经过衍生化来提高敏感度才能做到；3）脂肪胺的碱性强、活性高和极性大，导致其萃取或色谱分析相对较难。截至目前，国内外已建立了多种检测脂肪胺方法[6-10]，其中灵敏度比较高的方法主要是应用了柱前衍生化技术。衍生化的实施需要优良的衍生试剂，如：OPA-NAC，BCEC-Cl，FMOC-Cl 等。虽然这些试剂已被用于检测各种样品中的脂肪胺，但是它们还存在一些不足，例如灵敏度偏低和不稳定性。在前人研究的基础上，合成一种新型的荧光分子1-（1H-咪唑-1-基）-2-（2-苯基-1H-菲并）-[9,10-d] 咪唑-1-基）-乙酮（HPIE），借助经过衍生条件优化后的超声荧光探针衍生微萃取技术，结果发现，HPIE-胺分子具有强烈的荧光响应和离子流信号，该方法具有灵敏度高、选择性好和效率高等特点，HPIE 可作为评价和控制脂肪胺含量的优良荧光分子探针。

1.实验设计

1.1仪器与试剂

安捷伦HP1100系列（Waldbron，德国）配以荧光

检测器（FLD）（G1321A 型号）和自动采样器（G1329A 型号）。液相色谱/质谱联用仪（离子阱）1100型购自德国Bruker Daltonik 公司；采用Paratherm U2电子水浴器（Hitachi, 东京, 日本）控制温度。

12种脂肪胺标样（C1-C12）购自上海化学试剂公司，C1-C12为：甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、己胺、庚胺、辛胺、壬胺、癸胺、十一胺、十二胺；实验用水以Milli-Q 超纯水净化系统(Millipore, Bedford, MA, USA)制得。

1.2 色谱及质谱条件

Eclipse Hypersil BDS C18色谱柱（4.6mm×150mm，5µm）。流动相A：30%乙腈溶液，进行反向梯度洗脱（0–22min,，90%到55%；22–26min，55%到15%；26–33min，15%到0%，用甲酸/氨水作缓冲液（pH3.7，

10mmol/L）（1000/7.5，v/v），流动相B 为100%乙腈，流速控制在1.0mL/min，柱温设为30°C。流动相通过0.2mm 滤膜（Alltech, Deerfiled, IL）；衍生物用荧光检测法（λex 260nm 和λem 380nm）测定。

质谱条件：大气压化学电离（APCI）源，正离子检测方式，雾化压60 psi，干燥气体温度350°C，干燥气流量5.0L/min，电晕电流（nA）4000(pos)，毛细管

电压350v。

1.3 合成1-（1H-咪唑-1-基）-2-（2-苯基-1H-菲并）-[9,10-d]咪唑-1-基）-乙酮（HPIE）

称取2g N, N’-羰二咪唑加入至100mL 乙腈/二甲基亚砜溶剂中（v/v=1:2）。向所得溶液中加入3g 中间体PPIA 后，对反应体系进行加热回流1h。冷却至室温后，将溶液转移至300mL 冰水中，并剧烈搅拌10min；过滤析出物，水洗后，室温下风干48h。粗产品在乙腈溶剂中3次重结晶得白色晶体（合成路线如

新型脂肪胺检测荧光衍生试剂的合成及应用

孔　滨

（曲阜师范大学 实验教学与设备管理中心，山东　曲阜　273165）

摘　要：合成了新型荧光试剂1-（1H-咪唑-1-基）-2-（2-苯基-1H-菲并）-[9,10-d] 咪唑-1-基）-乙酮（HPIE），

并应用与标准样品中的12种脂肪胺发生衍生化反应，利用Eclipse Hypersil BDS C18色谱柱（4.6 mm × 150 mm, 5 µm）进行反向梯度洗脱，分离衍生物并进行荧光检测。最佳实验条件：以乙腈为溶剂，HPIE 与总脂肪胺的摩尔比值为4，80°C 下，衍生化反应时间10min 后获得稳定的荧光产物。结果显示，HPIE-胺衍生物的出峰信号稳定，线性相关系数大于0.9990，准确度、精密度和回收率高，检测限范围为：0.0022-0.0087ng/mL，灵敏度高，适用于分析环境样品中痕量脂肪胺。

关键词：荧光检测；柱前衍生；脂肪胺文章编号：ISSN2096-0743/2019-02-0069

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图1所示）。产率：79%，熔点：266.6-268.2°C（分解点）。高效液相色谱-常压化学电离-质谱：m/z 403.1 +；MS/MS: m/z 295.7 (分子核部分)。

图1 HPIE的合成路线

1.4 12种脂肪胺的衍生化

在10 mL 二甲基甲酰胺（DMF）溶液中溶解40.5 mg HPIE，配成浓度为:1.0×10-2mol/L的衍生化试剂，用乙腈稀释选用。将适量12种脂肪胺标样加入乙腈中，配制成20mL浓度为1.0 × 10-3 mol/L的溶液储备待用（反应式如图2所示）。校准所需标准溶液通过乙腈稀释储备液制成，浓度范围为0.0001-180ng/mL。进行质量控制（QC）的溶液配成3个浓度水平：0.005 ng/ mL，5 ng/mL和100ng/mL。将QC溶液和储备液分成小份，-20 °C 避光储存，待用。

图2 HPIE衍生化反应式

2.结果与讨论

2.1衍生条件的优化

影响HPIE与脂肪胺衍生化反应的条件主要有溶剂、衍生化试剂与脂肪胺的比例、温度和反应时间等。结果显示：对乙腈（ACN）、二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）和氯仿（CHF）四种有机溶剂进行筛选，在乙腈中的荧光响应比其它3种溶剂强，说明乙腈是获得高灵敏性的优选溶剂，被用于荧光光谱实验。观察10min到80min的检测范围内，壬胺始终保持较高的衍生效率，并且响应信号稳定（如图3），因此，只需将反应时间控制在10min即可实现对脂肪胺的选择性衍生提取和荧光检测。在其他条件一定的情况下，最佳衍生提取条件：HPIE与总脂肪胺的比例为4，温度80°C。

图3 衍生时间对衍生提取产率的影响（壬胺）

2.2 HPIE-胺衍生物的荧光光谱和稳定性

将HPIE（1.0ml，1.0×10-2M）和过量脂肪胺反应，制备单一的HPIE-胺衍生物，利用半制备的高效液相色谱(HPLC)对所得体系进行分离。选择峰较低的HPIE-C1来探索洗脱效率与光谱波长位移和稳定性的匹配关系（如图4所示）。称取3mgHPIE-C1衍生物溶于30mL乙腈中，将溶液分成两小份。一份用来溶于一些混合溶剂：1. DMF-H2O (1: 99 v/v); 2: DMF-H2O-ACN (1: 49: 50 v/v); 3: DMF-H2O-ACN (1: 29: 70 v/v); 4: DMF-H2O-ACN (1: 9: 90 v/v)，以乙腈和甲酸/氨水配成缓冲液(pH 3.7，10 mmol/L) (1000/7.5，v/v)；另一份储存在4°C冰箱中，并隔一天观察一次，连续一周。

结果可见，随着乙腈和水的体积比增加（S2，S3，S4），荧光强度的响应信号显著增强，而在DMF-H2O (1: 99 v/v) (S1)体系中，荧光强度最弱（如图4所示）。这可能是由于HPIE中的N原子被H2O分子质子化降低了荧光强度。在对不同溶剂的样品进行高效液相色谱-荧光检测过程中，从S2，S3，到S4，最大激发和发射波长几乎未变化，说明，检测波长没有出现显著的红移或者蓝移。另外，所有的衍生物使用同一溶剂作为流动相A，隔一天观察一次，持续一周，未发现明显变化。因此，HPIE-胺衍生物无论是在高效液相色谱-荧光检测过程中还是经过较长时间储存，其出

峰信号都非常稳定。

图4 不同溶剂对激发(Ex)与发射波长(Em)的影响（S1. DMF-H2O (1: 99 v/v); S2: DMF-H2O-ACN (1: 49: 50 v/ v); S3: DMF-H2O-ACN (1: 29: 70 v/v); S4: DMF-H2O-

ACN (1: 9: 90 v/v)）

2.3 标准样品的色谱分离

将待测物的衍生物注入Hypersil BDS C18柱，以荧光检测器进行高灵敏度检测。如图5所示，过柱后分离效果良好，在32min内即可完成荧光检测。从图中可以看出，12

种目标物实现了良好的分离。

图5 标准品脂肪胺衍生产物色谱分离荧光检测图