2无菌检查法

陕西德福康制药有限公司文件名称：标准操作程序—检验方法操作规程无菌检查法文件编号： SOP-QC255-00第 1 页共 9 页批准人日期QA审核日期审核人日期执行日期分发号起草人日期颁发部门质量保证部分发部门质量控制部1.目的建立无菌检查法检验标准操作规程，规范操作。

2.范围适用于无菌检查法。

3. 依据《中华人民共和国药典》2010 年版二部附录P103-107。

4.职责4.1 起草：QC 审核：QA 批准人：质量负责人4.2 QC 实施本规程。

4.3 QA 监督本规程的实施。

5. 内容5.1 概述5.1.1 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。

若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

5.1.2 无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

日常检验还需对试验环境进行监控。

5.1.3 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。

5.2 仪器、设备和用具5.2.1 无菌室分无菌操作间和缓冲间，在缓冲间内应有洗脸手盆、毛巾、无菌衣放置架或钩、拖鞋等，无菌室应具有空气除菌过滤的层装置，局部洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室温（18±26℃）及除湿装置，缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外光灯及照明灯，操作室或工作台应保持空气正压。

5.2.1.1 无菌室应每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭或2%甲酚酞擦试操作台及可能污染的死角，开动无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1小时，在每次操作完毕，同样用2%甲酚酞或0.1%新洁尔灭擦试工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌半小时。

5.2.1.2 无菌室的无菌程度检查，无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数取直径90mm双碟，在接种室内点燃酒精灯，在酒精灯旁，以无菌操作，将双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约15ml，制浅平板，在35-37℃预培48小时，证明无菌后将平板3个，以无菌方式带入无菌操作间的洁净区左、中、右各放一个，打开碟盖和置平板在空气中暴露30分钟后，将碟盖盖好，置35-37℃培养48小时，取出检查，3个平板上生长的菌落数相加总数不得过10个。

5.2.1.3 无菌操作台面或超净工作台，应定期检测其洁净度，应达到100级尘埃粒子＜5um 的粒数不得超过3.5/升；空气流量应控制在0.75-1.0m3/s，细菌菌落数平均＜1个，可根据无菌状况定期置换过滤器。

5.2.1.4 无菌室内应准备好盛有消毒用5%甲酚酞的玻璃罐，酒精灯，火柴，镊子75%酒精棉球，碘精棉及拖鞋等。

5.2.2 真空泵极限压力6×10-2Pa，抽数1L/S，转速1400r/min,功率为0.25KW。

置无菌室外，以耐压橡皮管通入无菌操作室。

5.2.3 恒温培养箱及可调的30-35℃生化培养箱。

5.2.4 离心机，显微镜、高压灭菌炉、恒温烤箱。

5.2.5 玻璃器皿，试管移液管，刻度吸管（1.5ml、10ml）、注射器（2.5ml、10ml）双碟等，用玻璃洗涤剂或清洁液浸泡，水洗3次，使用过后如与细菌接触，应先灭菌后倒出内容物，再清洗、晾干，凡无菌操作过程中所用的器皿都应用牛皮纸包扎严密121℃灭菌30分钟。

5.2.5.1 移液管，刻度吸管在管口上端，松松塞上少许棉花，然后放入吸管简内或牛皮纸袋内，消毒备用。

5.2.5.2 试管、离心管、三角瓶等在管（瓶）口塞上角棉胶专用塞或纱布棉塞，塞子应塞进管口内2/3处，用牛皮纸将管口包扎严，消毒备用。

5.2.5.3 注射器、针头（9、11、12号），将注射器与针头配对，将注射器、针头、管分别放在双层纱布内扎严，消毒备用。

5.2.6 无菌衣、裤帽、口罩等洗净晾干，配套用牛皮纸包严，消毒备用。

5.2.7 微孔滤膜，直径50mm，孔径0.45mm。

5.2.8 除菌滤器目前多采用STV2型无菌检查薄膜滤器装置，它是由除菌过滤器和底座排液管，两部分组成，新购置的滤器用毛刷将该装置各部件用水刷净，除去附着上的垢物，用水冲洗数次，纯化水冲洗2次，玻璃筒放于清洁液中，再用水及纯化水冲洗净晾干备用。

5.2.8.1 除菌滤器的装配将过滤器的漏斗的上面置1个橡皮圈，上面加多孔垫板，在垫板上垫一个四氯乙烯膜垫圈，放上己浸湿的微孔膜片，在其上再垫一个四氯乙稀薄膜垫圈。

按装玻璃筒，套上金属固定架，拧上底部圆螺母，漏斗底部大套上橡皮塞。

将除菌滤器放于铝板盒中，盖严，外面用牛皮纸包扎灭菌备用。

5.2.9 底座排液的排液管口接一条耐压橡皮管并将管口用纱布、牛皮纸包扎，灭菌备用。

5.2.10 手术镊、手术剪洗净，擦干，用双层纱布将1把剪子与1个镊子间隔包扎在一起放于铝钣盒内盖严，用牛皮纸包扎灭菌备用。

5.2.11 抽气瓶为1000-2000ml，用水及纯化水洗净晾干，瓶口用配有两个玻璃管（一个速至瓶底，一个短些）的橡皮塞盖紧，短的玻璃管套上一个短耐压橡皮管抽气口用耐压橡皮管与空气过滤玻璃器（内充填以棉花）相连，空气过滤玻璃器的另一管口用纱布、牛皮纸包扎严紧，抽气瓶的全部装置，用牛皮纸包扎，灭菌备用。

5.2.12 用具的灭菌将包扎妥的用具，在（121±0.5）蒸气灭菌30分钟，物品取出时切勿立即置冷处，适于高压灭菌的器皿也可采用160℃干热灭菌2小时。

5.3 培养基需气菌、厌气菌、真菌培养基按中国药典规定。

5.4 培养基灵敏度检查，按《中国药典》规定。

5.5 对照用菌液的制备5.5.1 金黄色葡萄球菌液取金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]的营养琼脂，斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内，在30-35℃培养16-18小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成1：106。

5.5.2 生孢梭菌菌液取生孢梭菌[CMCC（B）64941]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物少许，接种至相同培养基内，在30-35℃培养18-24小时后，用灭菌生理盐水稀释成1：106。

5.5.3 白色念珠菌菌液取白色念珠菌[CMCC（B）98001]的真菌琼脂培养基斜面培养物少许，接种至真菌培养基内在23-28℃培养24小时，用灭菌生理盐水稀释成1：105。

5.6 检查法的操作5.6.1 取备好的供试品，培养基在移入缓冲间之前应先编号，并用0.1%新洁尔灭或酒精棉擦试瓶（管）外壁，然后连同其他用具移入缓冲间，打开无菌间紫外光灯和空气过滤装置开关，并使其工作在1小时以上。

5.6.2 操作人员用肥皂水清洗双手，关闭紫外灯进入缓冲间，用碘酒棉，酒精棉擦手，穿戴衣帽口罩，将全部物品剥去牛皮纸移入灭菌室。

5.7 培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。

配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

制备好的培养基应保存在2-25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在1年内使用。

5.7.1 硫乙醇酸盐流体培养基的配制称取29.25g，加水1000ml加热煮沸使溶解，分装于试管中，（50ml/管）其装量与容器高度的比例应符合培养基结束后培养层氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。

灭菌。

在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟),迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。

硫乙醇酸盐流体培养基置30~35℃培养。

5.7.2 改良马丁培养基配制称取28.5g,加水1000ml加热煮沸使溶解,分装与试管中,(50ml/管)。

改良马丁培养基置23~28℃培养。

5.7.3 选择性培养基按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法,在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法验证试验。

5.8 培养基的适用性检查5.8.1 无菌检查用的硫乙醇盐酸流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。

本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。

5.8.2 无菌性检查每批培养基随机取下不少于5支(瓶),培养14天,应无菌生长。

5.9 灵敏度检查菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代),并采用适宜的菌种保藏技术,以保证实验菌株的生物学特性。

金黄色葡萄球菌 (Staphy lococcus aureus）〔CMCC(B)26 003〕铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC(B)10 104〕枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)〔CMCC(B)63 501〕生孢梭菌（Clostridium sporogenes)〔CMCC(B)64 941〕白色念珠菌（Candida albicans)〔CMCC(F)98 001〕黑曲霉(Aspergillus niger)〔CMCC(F)98 003〕5.10 菌液制备接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35℃培养18~24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，23~28℃培养24~48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23~28℃培养5~7天，加入3~5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨醇80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。

5.11 菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2~8℃，可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃，在验证过的贮存期内使用。

5.12 培养基接种取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。