XBP1调控胶质瘤细胞氧化应激的实验研究说课讲解
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➢ 流式细胞技术检测ROS蓄积和线粒体膜电位； ➢ 检测比较细胞内抗氧化分子表达水平； ➢ 将细胞进行XBP1基因过表达，观察能否起到相反的效果； ➢ 应用启动子突变分析探讨XBP1促抗氧化分子转录活性的机制。
实验结果一
对H2O2的敏感性比较
survival fraction(%of total)
XBP1与细胞抗氧化分子的表达
Random C 1h 2h 3h
SiXBP1 C 1h 2h 3h
Catalase
SOD1
TRX1
GAPDH
Random C 3h 6h 9h
SiXBP1 C 3h 6h 9h
Catalase 14-3-3
H2O2 处 理 细 胞 后 未 见 Catalase 、 SOD1 和 TRX1表达变化
**P<0.01
2
4
6
rel ati ve acti vi ty (fol d)
Catalase启动子突变
实验结果七
XBP1促进NF-Y与Catalase启动子结合
凝胶电泳迁移分析（EMSA）
实验结果七
XBP1促进NF-Y与Catalase启动子结合
染色质免疫沉降
小结
Oxidative stress
antioxidant genes (Catalase, SOD1, etc)
transcripts transcripts transcripts
ERSE XBP1 NF-Y
target genes
transcripts transcripts transcripts
实验设计
➢ 胶质瘤细胞系U251MG进行RNA干扰，抑制XBP1基因表达后比 较细胞对外源性活性氧H2O2的敏感性；
实验结果三
抑制XBP1细胞内活性氧（ROS）明显增高
H2O2
Random
SiXBP1
C 1h 2h 3h 4h C 1h 2h 3h 4h
P-JNK
JNK-1
P-P38 P38
PTL
Random
C 1h 2h 4h 6h
SiXBP1
C 1h 2h 4h 6h
P-P38
ห้องสมุดไป่ตู้
P38
实验结果四
XBP1与细胞抗氧化分子的表达
6.7
100 101 102 103 104 FL1-H
C
41.5
100 101 102 103 104 FL1-H
PTL
23.5
100 101 102 103 104 FL1-H
FK22 8
21.3
100 101 102 103 104 FL1-H
VP16
实验结果三
抑制XBP1细胞内活性氧（ROS）明显增高
实验结果四
XBP1与细胞抗氧化分子的表达
c e ll d e a th (% o f to ta l)
100 80 60 40 20 0 C
**P<0.01
AT H2O2 AT+H2O2
AT H2O2 C 1h 2h 3h C 1h 2h 3h
PP38 P38
C
0.9
M1
AT 0.9
M1
0 200 400 600 FL2-A
9.0
100 101 102 103 104 FL1-H
SiXBP1-C
15.2
100 101 102 103 104 FL1-H
SiXBP1-PTL-20
28.6
100 101 102 103 104 FL1-H
SiXBP1-FK228
26.9
100 101 102 103 104 FL1-H
SiXBP1-VP16
cell death(%of total)
50
random
SiXBP1
40
30
20
10
0 C
VP16
FK228
对其它2种化疗药物诱导的细胞死亡没有明显区别
实验结果二
XBP1缺失特异性增强细胞对氧化应激的敏感性
Random-C.001
Random-PTL-20
Random-FK228
Random-VP16
Catalase
SOD1 b-actin XBP1
ROS (fold increase)
7 6 5 4 3 2 1 0
C
H2O2
P<0.01 **
mock XBP1
实验结果六
XBP1可增强Catalase转录活性
CAT(-1394/+68) CAT(-191/+68)
vehicle 0
mock
XBP1
Random
C (4.6) 3h 12.1
100
SiXBP1
101
102
FL1-H
C (3.8)
3h 24.9
100
101
102
FL1-H
R O S (fo ld in c re a s e )
6 R andom
5
S iX B P 1
4
3
*
2
1
0
0
1h
** *
2h
3h
DCFH-DA孵育细胞，流式细胞技术检测细胞内ROS堆积： *P<0.05, **P<0.01
c a ta la s e tra ns c ripts (fo ld)
Random XBP1
Catalase SOD1 TRX1 GPX GAPDH
1 .0
0 .8
0 .6
0 .4
**
0 .2
0 .0
random
SiXBP1
抑制XBP1后细胞中抗氧化分子的mRNA水平 (**P<0.01)
实验结果四
XBP1调控胶质瘤细胞氧化应激的 实验研究
刘耀华 赵世光 陈晓丰 梁元 郑秉杰
哈尔滨医科大学附属第一医院 神经外科
ROS
The Achilles’ Heel of cancer cells(Cancer Cell. 2008;14(6):427-9 IF 24.962)
Catalase SOD
Exogenous ROS:CTanhceerlCaesltl 1s4t,rDaewcebmrbeera9k,s20t0h8e camel's back.
100
80
*
60
**
40
20
0 0
**
0.1
0.25
0.5
1
H2O2 concentration (mM)
Random
SiXBP1
H2O2处理后trypan blue检测细胞生存情况 *P<0.05, **P<0.01
实验结果一
对H2O2的敏感性比较
-C
H2O2-0.5
Random
7.1
100 101 102 103 104 FL1-H
H2O2 17.0%
M1
0 200 400 600 FL2-A
AT-H2O2.018 62% M1
0 200 400 600 FL2-A
0 200 400 600 FL2-A
Catalase特异性抑制剂AT预处理的影响
实验结果五
XBP1可增强Catalase转录活性
U251 XBP1过表达 mock XBP1
survival fraction(%of total)
100 80 60 40 20 0 0
* **
**
5
10
20
40
PTL concentration (uM)
Random
SiXBP1
对活性氧诱导剂PTL的敏感性比较（*P<0.05, **P<0.01)
实验结果二
抑制XBP1特异性增强细胞对氧化应激的敏感性
Oxidative stress
Oxidative stress
ROS
ROS
ROS
XBP1
XBP1 XBP1
Cell Catalase Death
Catalase
Catalase
transcripts transcripts transcripts
NF-Y CCAAT
NF-Y CCAAT
Catalase gene
-C
2299..44
100 101 102 103 104 FL1-H
H2O2-0.5
SiXBP1
5.4
100 101 102 103 104 FL1-H
60.3
100 101 102 103 104 FL1-H
13.0
流式细胞技术检测线粒体膜电位（MMP）
实验结果二
抑制XBP1特异性增强细胞对氧化应激的敏感性
*P<0.05 **P<0.01
20
40
60
rel ati ve acti vi ty (fol d)
荧光素酶（luciferase）活性分析
实验结果六
XBP1可增强Catalase转录活性
wild type GC box2 CCAAT box2 CCAAT box(2/3)
0
mock
XBP1
**P<0.01 **P<0.01
研究背景
活性氧（ROS）与胶质瘤
➢ 肿瘤，包括胶质瘤可以产生高水平活性氧； ➢ 肿瘤细胞的Akt过度激活，决定了其对活性氧敏感; ➢ 大量活性氧可以杀伤肿瘤，很多化疗药物为活性氧诱导剂; ➢ 调控胶质瘤细胞氧化应激水平可能对其治疗具有积极意义。
CCAAT NF-Y ? XBP1
CCAAT NF-Y
实验结果一
对H2O2的敏感性比较
survival fraction(%of total)
XBP1与细胞抗氧化分子的表达
Random C 1h 2h 3h
SiXBP1 C 1h 2h 3h
Catalase
SOD1
TRX1
GAPDH
Random C 3h 6h 9h
SiXBP1 C 3h 6h 9h
Catalase 14-3-3
H2O2 处 理 细 胞 后 未 见 Catalase 、 SOD1 和 TRX1表达变化
**P<0.01
2
4
6
rel ati ve acti vi ty (fol d)
Catalase启动子突变
实验结果七
XBP1促进NF-Y与Catalase启动子结合
凝胶电泳迁移分析（EMSA）
实验结果七
XBP1促进NF-Y与Catalase启动子结合
染色质免疫沉降
小结
Oxidative stress
antioxidant genes (Catalase, SOD1, etc)
transcripts transcripts transcripts
ERSE XBP1 NF-Y
target genes
transcripts transcripts transcripts
实验设计
➢ 胶质瘤细胞系U251MG进行RNA干扰，抑制XBP1基因表达后比 较细胞对外源性活性氧H2O2的敏感性；
实验结果三
抑制XBP1细胞内活性氧（ROS）明显增高
H2O2
Random
SiXBP1
C 1h 2h 3h 4h C 1h 2h 3h 4h
P-JNK
JNK-1
P-P38 P38
PTL
Random
C 1h 2h 4h 6h
SiXBP1
C 1h 2h 4h 6h
P-P38
ห้องสมุดไป่ตู้
P38
实验结果四
XBP1与细胞抗氧化分子的表达
6.7
100 101 102 103 104 FL1-H
C
41.5
100 101 102 103 104 FL1-H
PTL
23.5
100 101 102 103 104 FL1-H
FK22 8
21.3
100 101 102 103 104 FL1-H
VP16
实验结果三
抑制XBP1细胞内活性氧（ROS）明显增高
实验结果四
XBP1与细胞抗氧化分子的表达
c e ll d e a th (% o f to ta l)
100 80 60 40 20 0 C
**P<0.01
AT H2O2 AT+H2O2
AT H2O2 C 1h 2h 3h C 1h 2h 3h
PP38 P38
C
0.9
M1
AT 0.9
M1
0 200 400 600 FL2-A
9.0
100 101 102 103 104 FL1-H
SiXBP1-C
15.2
100 101 102 103 104 FL1-H
SiXBP1-PTL-20
28.6
100 101 102 103 104 FL1-H
SiXBP1-FK228
26.9
100 101 102 103 104 FL1-H
SiXBP1-VP16
cell death(%of total)
50
random
SiXBP1
40
30
20
10
0 C
VP16
FK228
对其它2种化疗药物诱导的细胞死亡没有明显区别
实验结果二
XBP1缺失特异性增强细胞对氧化应激的敏感性
Random-C.001
Random-PTL-20
Random-FK228
Random-VP16
Catalase
SOD1 b-actin XBP1
ROS (fold increase)
7 6 5 4 3 2 1 0
C
H2O2
P<0.01 **
mock XBP1
实验结果六
XBP1可增强Catalase转录活性
CAT(-1394/+68) CAT(-191/+68)
vehicle 0
mock
XBP1
Random
C (4.6) 3h 12.1
100
SiXBP1
101
102
FL1-H
C (3.8)
3h 24.9
100
101
102
FL1-H
R O S (fo ld in c re a s e )
6 R andom
5
S iX B P 1
4
3
*
2
1
0
0
1h
** *
2h
3h
DCFH-DA孵育细胞，流式细胞技术检测细胞内ROS堆积： *P<0.05, **P<0.01
c a ta la s e tra ns c ripts (fo ld)
Random XBP1
Catalase SOD1 TRX1 GPX GAPDH
1 .0
0 .8
0 .6
0 .4
**
0 .2
0 .0
random
SiXBP1
抑制XBP1后细胞中抗氧化分子的mRNA水平 (**P<0.01)
实验结果四
XBP1调控胶质瘤细胞氧化应激的 实验研究
刘耀华 赵世光 陈晓丰 梁元 郑秉杰
哈尔滨医科大学附属第一医院 神经外科
ROS
The Achilles’ Heel of cancer cells(Cancer Cell. 2008;14(6):427-9 IF 24.962)
Catalase SOD
Exogenous ROS:CTanhceerlCaesltl 1s4t,rDaewcebmrbeera9k,s20t0h8e camel's back.
100
80
*
60
**
40
20
0 0
**
0.1
0.25
0.5
1
H2O2 concentration (mM)
Random
SiXBP1
H2O2处理后trypan blue检测细胞生存情况 *P<0.05, **P<0.01
实验结果一
对H2O2的敏感性比较
-C
H2O2-0.5
Random
7.1
100 101 102 103 104 FL1-H
H2O2 17.0%
M1
0 200 400 600 FL2-A
AT-H2O2.018 62% M1
0 200 400 600 FL2-A
0 200 400 600 FL2-A
Catalase特异性抑制剂AT预处理的影响
实验结果五
XBP1可增强Catalase转录活性
U251 XBP1过表达 mock XBP1
survival fraction(%of total)
100 80 60 40 20 0 0
* **
**
5
10
20
40
PTL concentration (uM)
Random
SiXBP1
对活性氧诱导剂PTL的敏感性比较（*P<0.05, **P<0.01)
实验结果二
抑制XBP1特异性增强细胞对氧化应激的敏感性
Oxidative stress
Oxidative stress
ROS
ROS
ROS
XBP1
XBP1 XBP1
Cell Catalase Death
Catalase
Catalase
transcripts transcripts transcripts
NF-Y CCAAT
NF-Y CCAAT
Catalase gene
-C
2299..44
100 101 102 103 104 FL1-H
H2O2-0.5
SiXBP1
5.4
100 101 102 103 104 FL1-H
60.3
100 101 102 103 104 FL1-H
13.0
流式细胞技术检测线粒体膜电位（MMP）
实验结果二
抑制XBP1特异性增强细胞对氧化应激的敏感性
*P<0.05 **P<0.01
20
40
60
rel ati ve acti vi ty (fol d)
荧光素酶（luciferase）活性分析
实验结果六
XBP1可增强Catalase转录活性
wild type GC box2 CCAAT box2 CCAAT box(2/3)
0
mock
XBP1
**P<0.01 **P<0.01
研究背景
活性氧（ROS）与胶质瘤
➢ 肿瘤，包括胶质瘤可以产生高水平活性氧； ➢ 肿瘤细胞的Akt过度激活，决定了其对活性氧敏感; ➢ 大量活性氧可以杀伤肿瘤，很多化疗药物为活性氧诱导剂; ➢ 调控胶质瘤细胞氧化应激水平可能对其治疗具有积极意义。
CCAAT NF-Y ? XBP1
CCAAT NF-Y