第三章 微生物细胞培养技术汇总

四、同步生长：
同步培养法：能获得处于同一生长阶段 的群体细胞的培养方法 同步生长：运用同步培养技术，控制微 生物生长，使之处于同一生长 阶段并同时分裂。
获得同步生长的方法：
1. 机械法— 收集同样大小的细胞
密度梯度离心： 选择性滤膜法:
2. 调整生理条件法：
温度、光、限制因子等
例：温度开始很低，使其均处在 仅活着的状态 —— 升高温度 —— 同步生长
３．意义：
（１）代谢、生理研究的好材料 （２）生产中用其作种
(三)稳定期（stationary phase): 1.现象：活菌数目不增不
减，生长速率趋于0,曲 线有一下降的趋势。
2. 特点:细胞的菌体形态典型，
芽孢形成，细胞内开始 贮藏物质。
3.出现原因：
1）营养物质大量消耗； 2）有毒代谢产物大量积累； 3）外界条件影响（pH、高细胞浓度，氧化还原电位等）
（一）迟缓期（lag phase）
1.现象：活菌数没增加，曲线平
行于横轴。
2.原因：由于细胞进入新环境,
细胞数目无增长，甚至有所下 降有一个适应过程，进行大量 的酶（诱导酶）的生成。
3.细胞特点:细胞的新陈代谢非
常旺盛，个体体积显著增大， 为细胞分裂作准备。
4.此期长短：与菌种遗传特性、菌龄、接种量、培
•
人工控制发酵罐多传感器、计算机在线控制的自动发酵
一 、表面培养
• 实验室进行表面培养常采用试管、扁瓶 和培养皿。 • 浅盘培养
表面培养法，操作简便，设备简单， 常用于实验室小规模培养。 但也存在一些缺点： （1）用于大规模生产的潜力很小； （2）不便于对体系进行监测控制； （3）不易于保持系统内环境条件的均一。
连续培养的主要问题： （1）随着操作时间的增加，染菌的机率 增大。如提高培养温度、改变 pH 或原料 等，可使杂菌不易生长。 (2)连续培养的另一个问题是在长期的 培养中，菌种发生变异，引起生产能力 下降。
固定化细胞连续培养
细胞固定化是通过包埋法、微胶囊法、吸附法 等将细胞固定在载体的内部或表面 ，加入营养 液及合适的培养条件，得到代谢产物。 优点：可提供高密度的细胞；减少细胞的流失， 反复利用；简化细胞与代谢产物的分离工艺。 缺点：成本高；易污染；物质传递阻力大； 只能用于细胞分泌型产物的发酵。
六、混合培养
H2 葡糖杆菌 巨大芽孢杆菌 如 D-葡萄糖D-山梨醇L-山梨糖2-酮基-L-古龙酸
七、高密度培养
指微生物在液体培养基中细胞群体密 度超过常规培养10倍以上时的生长状态 或培养技术。现代高密度培养技术主要 是用于基因工程菌生产多肽类药物。 选取最佳培养基成分和各成分含量 补料 提高溶解氧的浓度 防止有害代谢产物的生成
2. 细胞特点： 此 时 细 胞 的
大小、组成、生理特征等 均趋于一致，代谢活跃， 生长速率高，代时稳定。
２．代时（世代时间Ｇeneration time, G）： 单个细胞完成一次分裂所需要的时间
G= t / n=
t1 — t0
3.3(lgx—lgx0)
（１）Ｇ与菌种有关； （２）受培养条件(温度、营养成分）的制约； 同一菌种在不同培养条件下代时不同
二 、深层培养
• • • • 厚层通风培养 厌氧培养 摇瓶 大型发酵罐
用于HBaidu Nhomakorabeangate滚管技术中的厌氧试管剖面图
厌氧手套箱
fermenter
生长曲线：
将少量单细胞的纯 培养，接种到一恒定容 积的液体培养基中，在 适宜条件下培养，定时 取样，测菌量。以培养 时间为横坐标，以细菌 增长数目的对数为纵坐 标，绘制所得的曲线。
（二）恒化培养
概念：以恒定流速使营养物质浓 度恒定而保持细菌生长速率恒定 的方法。 原理：恒化器中动态平衡的稳定 性，是以某种生长限制因子（如 碳、氮源；生长因子；无机盐等） 的浓度来控制菌的生长速度。 特点：维持营养成分的低浓度， 控制微生物生长速率。
连续培养的优点
1、缩短发酵周期，提高设备的利用率； 2、便于自控。降低动力消耗及劳动强度； 3、产品均一；
（四）衰亡期 1.现象：细胞死亡速率>生长
速率。一般总菌数不变,活菌 数曲线下降。
2. 特点： 菌体变形 ，大小
不一，细胞出现自溶,生理代 谢活动停滞。
三 、连续培养
• 恒浊法 • 恒化法
（一）恒浊培养
概念：在恒浊器内，调节培养 基流速，使细菌培养液浊度保持
恒定的连续培养方法。
原理：维持菌浓度不变。 特点：基质过量，菌以最高速率 生长；但工艺复杂，烦琐。
第三章 微生物细胞培养与控制技 术
第一部分：培养技术
微 生 物 培 养 技 术 的 发 展
• • • •
少量培养大规模培养 浅层培养厚层或深层液体培养 固体培养液体培养 静止培养通气搅拌液体培养
•
• • • •
单批培养连续培养到多级培养
分散固定化细胞 野生菌种突变、遗传工程菌种 单菌发酵混菌发酵 低密度高密度
4. 意义：
1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等）， 生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下： • 补充营养物质（补料） • 调pH • 调整温度 2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。
3）产量常数：
概念：表示微生物对基质利用效率的高低 Y=菌体干重/消耗营养物质的浓度
根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量 如：Y=0.5，表示要得到5g菌体，需某营养物（葡萄 糖）10g。
养条件有关。
5.意义：在实际工作中，缩短lag
phase 的措施： 1）加大接种量（群体优势----适应性增强） 2）先用对数其的种子（此时细胞分裂旺盛） 3）调整培养基的成分，使种子基含有发酵培养基的成分 4）选用繁殖快的菌种
（二）对数期(log phase) 1. 现象： 细胞数目以几何级
数增加，其对数与时间 呈直线关系。
３. 抑制ＤＮＡ生长法：
加入代谢抑制剂，阻遏DNA 复制——解阻遏——同步
五、中间补料培养
（ 1 ）有利于消除或减少因易被利用基质（如葡 萄糖）引起的抑制作用的影响。 （ 2 ）使培养过程中的需氧量能适应培养设备的 供氧能力。 （ 3 ）避免培养基中的有毒组分（如青霉素发酵 中作为前体的苯乙酸）对培养的影响。 （4）中间补料可为实现高密度培养创造条件。