革兰氏染色法

G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类 脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚 糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌 仍保留初染时的颜色
1、菌株：大肠杆菌（Escherichia coli ）；金黄色 葡萄球菌（ ） Staphyloccocus aureus Rosenbach
2、流程路线： 涂片 干燥 固定 草酸铵结晶紫 染色1min 水洗干燥 碘液媒1min 水洗干燥 95%乙醇脱色 15~20s 水洗干燥 番红复染1min 水洗干燥 镜鉴
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这 两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的 类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低， 故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增 加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和 碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色， 再经蕃红复染后就成红色。
（4）选用培养16-24 h菌龄的细菌为宜。若菌龄太 老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴 性反应。
大肠杆菌Х1000倍
金黄色葡萄球菌 Х1000倍
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1.大肠杆菌呈 色，是革兰氏 性菌；金黄 色葡萄球菌呈 色，是革兰氏 性菌。
2.按比例绘出所观察细菌形态图
(1)涂片 干燥 固定:
1
2
（2）草酸铵结晶紫染色1min 水洗干燥
（3）碘液媒染1min 水洗 干燥
（4）95%乙醇脱色15~20秒 水洗 干燥
（5）番红复染1min 水洗 干燥 镜检
油镜镜检
一般是经低倍、高倍到油镜
低倍寻找到目标物后,把镜头转成八字形后,玻 片上加油，转到油镜,从侧面观察，将油浸镜 下移到与玻片稍微接触为止，然后用微调向上 提升调准焦点，到看清物像为止。并绘出形态 图。
实验三 革兰氏染色法
一、目的与要求： 1、了解革兰氏染色法原理。 2、学习并掌握油镜的使用。 3、学习判断微生物染色法技术，
微生物革兰氏反应。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram 所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性 菌（G+）和革兰氏阴性菌（ G- ）两大类，是细 菌学上最常用的鉴别染色法（KOH溶解试验和氨 基肽酶试验可用作辅助试验）。
观察完毕，上旋镜筒，取出标本片之后， 先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后沾取少 许二甲苯。擦去镜头上残留油迹，最后再 用擦镜纸擦去残留的二甲苯。勿用手或其 他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦镜 显微镜的机械部分
将各部分还原，反光镜垂直于镜座、将物 镜转成八字形在向下旋，同时把聚光镜降 下，才可以镜入镜箱内。
五、注意事项：
（1）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都 不易均匀，固定时，不可过热，以载玻片不烫手为 宜。
（2）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步 骤。如脱色时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌， 时间不足，革兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。
（3）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反 应为准。