免疫组化与原位杂交

1、固定剂：
用于免疫组织化学的固定剂种类较多， 性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其要 重视固定剂的选择。常用醛类固定剂。
2、注意事项：
应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。 组织块不宜过大过厚, 必须小于2cm×1.5cm×0.3cm，
尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内。 固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍
㈡ 抗体(Antibody)：
是机体受抗原刺激后，在体液中出现的一种 能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，称为免 疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)。
1、多克隆抗体：
多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物（大 多数为兔），并从该动物血中所获得的免疫血清。它 是针对抗原分子上多个抗原决定簇的多个B淋巴细胞 克隆分泌的抗体。
免疫组化与原位杂交
免疫组织化学的主要原理是用荧光素、生物 素或地高辛等标记的抗体（或抗原）对细胞 或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、 定位或定量检测，经过组织化学的呈色反应 之后，用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜 观察。
一、抗原和抗体
㈠ 抗原(Antigen)：
凡能刺激机体产生抗体，并能与抗体发生特 异性结合的物质称为抗原。物质所具有的这种特 性称为抗原性(Antigenicity)。
㈠ 冰冻切片:
是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。 其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫 活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜 的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。
冰冻切片后如不染色，必须吹干，贮存低温冰箱 内，或进行短暂预固定后贮存冰箱保存。
㈡ 石蜡切片:
其优点是组织结构保存良好，在病理和 回顾性研究中有较大的实用价值，能切连续 薄片，组织结构清晰，抗原定位准确。
五、抗原修复
抗原修复是指通过加热或酶消化的 方法使经醛类固定剂处理的组织的免疫 组化染色效果增进。
常用的抗原修复方法
胰蛋白酶消化法：可打开醛键，解除交联， 暴露抗原
高压加热法：保持高压5分钟，后使液体 缓慢恢复至室温。可暴露抗原
微波加热法：10分钟或5分钟2次。可解除 交联。
六、免疫组化染色的一般步骤

PBS液洗涤：5分钟×2次；

SABC：室温或37 ℃30分钟；
PBS液洗涤：5分钟×4次。
注：
一抗为针对抗原的特异性抗体。 二抗一般为生物素化二抗，即生物素化羊
抗小鼠或生物素化羊抗兔。 SABC即ABC复合物（亲合素-生物素-过氧
化物酶复合物）。
5、检测：即显色反应
酶作用底物： DAB—辣根过氧化物酶 NBT/BCIP—碱性磷酸酶
以上，否则组织中心固定不良影响效果。 组织固定后应充分水洗，去除固定液，以减少固定液
造成的人为假象。
3、固定方法：
浸入法(Immersion method)： 将组织浸泡在固定液内， 必要时可在低温
(4℃)环境下进行，固定时间可根据抗原的稳定 性以及固定液性质而定， 一般在2~12h之间。
灌注法(Irrigation method)： 此法适用于动物实验研究。灌注法固定可
2、单克隆抗体：
单克隆抗体是应用细胞融合杂交瘤技术通过免 疫动物（大多数为小鼠）而制备的。它是针对一种 抗原决定簇的一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体。
㈢ 抗原与抗体的关系：
没有抗原的刺激，机体不能产生抗体；没有抗 原物质，也无法检测抗体的存在，利用抗体可以检 测抗原物质。
二、细胞和组织标本的取材和固定
使固定液迅速达到全身各组织，达到充分固定 之目的。灌注中洗还能排除红细胞内假过氧化 物酶的干扰。
三、玻片的处理
洗涤载玻片 防脱片剂(APES)处理
四、组织切片
应用于光镜的免疫组织化学染色的切片 厚度一般要求5µm左右，神经组织的研究要 求切片厚度在 20~100µm，有利于追踪神经 纤维的走行。
6、复染：苏木素、核红、1-2%甲基绿 7、脱水、透明、封片：
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七、免疫组化染色注意事项
㈠ 抗体的保存和配制：
1、抗体的保存：
放入-20℃~-40℃冰箱中保存备用, 一般 可保存1~2年。小量分装的抗体可1次用完， 避免反复冻融而影响效价的降低。一般用前 新鲜配制使用液体，稀释的抗体不能长时间 保存，在 4℃可存放1~3天，超过7天效价显 著降低。有浓缩抗体和即用型抗体。
为充分保存组织的抗原性，标本离体后应 立即作处理，或立即速冻成冰块进行冰冻切片， 或立即用固定液处理，进行脱水、浸蜡、包埋、 石蜡切片。如不能迅速制片，可贮存于液氮罐 内或-70℃冰箱内备用。
㈡ 固定：
固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝 固，终止或抑制外源性和内源性酶活性， 更重要的是最大限度的保存细胞和组织的 抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗 原，防止抗原弥散。
由于各种抗原的生化、物理性质不同，如 温度高低、酸碱度强弱及各种化学试剂的作用 均可影响抗原的免疫学活性，良好的细胞和组 织结构将有助于抗原的准确定位。因此，细胞 和组织标本的采集制备在免疫组织化学技术中 占有十分重要的位置。
㈠ 取材：
1、细胞标本的取材：
穿刺吸取涂片法 该法穿刺吸取直接涂片的优点是操作简便，细 胞形态保持较好。缺点是细胞分布不均匀。 体液沉淀涂片法 主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多、 细胞少的标本。体液采取后，必须及时处理， 更不宜加固定液。
1、石蜡切片脱蜡到水： 2、预处理：需要时可选用3%过氧化氢溶液阻
断过氧化物酶。
3、抗原修复处理：根据需要选用
4、染色：

PBS液洗涤：5分钟×2次；

正常山羊血清封闭：室温或37℃20分钟；

滴加一抗：37 ℃1-2小时或4 ℃过夜；

PBS液洗涤：5分钟×2次；

滴加二抗：室温或37 ℃30分钟；
培养细胞标本的取材:
可根据培养的细胞特性分别采取不同的方法。某些 细胞有贴壁生长的特性，只需将载玻片或盖玻片插 入培养液内即可收集到理想的细胞标本。某些细胞 只能在培养液中生长，可用上述体液沉淀离心涂片 法处理。
2、组织标本的取材：
组织标本主要取之于活组织检查标本、手术切 除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本等。前三 者均为新鲜组织，后者是机体死亡 2h以上的组织， 可能有不同程度的自溶， 其抗原可能有变性消失， 严重弥散现象，因此， 尸检组织应尽快固定处理， 以免影响免疫组化标记效果。