长期毒性试验

大鼠的长期毒性试验
1. 目的：观察连续给予受试动物后由于积蓄而对机体产生的毒性反应及其严重程度，提供毒性反应的靶器官及其损害的可逆性，确定无毒性反应剂量，为人用安全剂量提供参考。

试验条件：
2动物：应写明动物的品系，生产单位及生产合格证号，等级，周龄，性别，体重，一般选用动物品系有Wistar、SD、或其他品系的远交系动物。

应根据试验期的长短选用不同周龄的大鼠，试验期在3个月内宜用6～8周龄大鼠，超过三个月者宜用5～6周龄大鼠。

试验开始时，体重差异应不超过平均体重的20%。

实验动物应雌雄分笼饲养，每笼不宜超过5只动物，所有动物试验前至少观察一周，并记录食量和体重等基础数字。

试验报告中应写明饲料供应单位及生产合格证，若用自己配置的饲料，应提供配方及成分含量的检测报告；应写明饲养动物实验室的合格证(未获得合格证者也应注明)及等级。

受试物：应写明受试物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配置方法。

受试物可以是临床试验制剂。

如受试物制剂的体积较大，以不含赋形剂的制剂，如中药浸膏为宜。

固态制剂灌胃给药，可选择适当的溶媒溶解，或研磨成细粉后用1%左右羧甲基纤维素钠(或10%阿拉伯明胶)制成混悬液，但应注意临用前需要摇匀。

避免混悬不匀引起计量误差。

长期毒性试验给药周期较长，固体制剂在配成溶液或混悬液后，冰箱放置，短期内用完，一面受试药物活性降低。

3试验方法：
①受试物剂量：一般设三个剂量组和一个对照组。

给受试物剂量单位一般用mg/kg、
或g/kg表示。

高剂量组：应使动物产生明显的或严重的毒性反应，或个别动物死亡。

中剂量组：应相当或高于药效学试验的高剂量，应使动物产生轻微的或中等程度的毒性。

低剂量组：略高于整体动物的有效剂量，在此剂量下动物应不出现毒性反应，属基本安全剂量。

对照组：不给收拾药物仅给等容量的溶媒或赋形剂，若所用溶媒或赋形剂可能有毒时，另加一组空白对照。

如果急性毒性试验结果毒性很低，测不出LD50，也未见明显毒性反应，可设高、低两个剂量，高剂量一般为拟用于临床剂量50倍以上(有困难时，可适当减少剂量，最低不能低于临床剂量30倍)并应高于药效学试验的高剂量。

每组动物不宜少于20只，雌雄各半，若试验在三个月以上的，应适当增加动物数。

②给药方法：给药途径应与推荐临床途径一致，口服药大鼠一般用灌胃法，临床
用药途径为静脉注射时，可用其他适宜的注射途径代替。

口服药物长期给药亦可采用掺饲法，即将受试物混入饲料让动物自行食入或将受试物掺入饮水中给予。

采用此种方法给药时应提供受试药物与饲料或饮用水混合的均匀性，受试药物的稳定性及有关质量检查等方面的资料，以确定获得准确可靠的实验结果，同时还有适当的措施，保证动物在规定的时间内摄入规定的剂量，否则剂量难以得到保
证。

故采用此法，申报时应说明摄入规定药量的措施。

③给药容量：一般为1～2ml/100g体重，应根据体重增长调整给药量，用不等浓
度等容量给药。

④给药时间：受试物最好是每周7天连续给予。

如试验期为三个月或超过三个月
时，也可以采用每周给药六天。

每天给药时间相同。

⑤给药周期：长毒试验的给药时间应为临床试验用药的2～3倍，最长半年。

临床用药周期为1～3天者，可免做大鼠长期毒性试验；若临床用药周期在1周以内者长期实验应为2周；2周以内者，应为4周；四周以上者，长期毒性试验的给药期一般为临床试验用药期的两倍以上。

⑥外用要治疗局部疾患的，方中不含毒性药材或有毒成分，可不做长期毒性试验，
但需做局部刺激试验、过敏试验，必要时需做吸收试验。

如外用要治疗全身疾患时，还应作长期毒性试验。

4. 检测项目
①一般观察
饲料和饮水消耗：应每周记录，并与体重变化对照观察。

体重变化情况：应每周称重记录，若给药周期≥90天，可每十天称重记录，它能反映动物的生长情况和一般健康状况，并根据体重变化改变给药量。

毒性状况：应每天注意观察，记录有无毒性症状出现。

毒性症状的观察或检测包括以下几个方面：中枢和运动神经系统(行为、异常运动、对刺激的反映、神经反射和肌张力)，神经植物系统(瞳孔和分泌物)，呼吸系统(鼻、呼吸及频率)，心血管系统(心前区触诊)。

胃肠系统(大便、腹部形态、大便次数、硬度和颜色)，泌尿生殖系统(阴唇、乳腺、会阴部)，皮肤和皮毛(颜色、完整性)，眼(眼睑、眼球)和其他(注射部位、一般状况)。

群养时应将发现中毒反映的动物及时取出单笼饲养，重点观察。

由于毒性症状有些尽在给药后一定阶段出现，可逐渐自行消失或减轻，也可随时间进行性发展，因此必须列表逐日或逐周(逐个动物)记录，以便看出症状发生、发展的过程，以及各种症状出现的先后次序。

这对于判断药物毒性和指导临床具有重要意义。

发现死亡和濒临死亡动物应及时尸检。

②血液指标：应检查红细胞或网织红细胞计数、血红蛋白(Hb)、白细胞总数及其分类、血小板、凝血时间，三四类中药新药，如方中所用各味药材均符合法定标准，物毒性药材或毒性成分，检查项目可简化为红细胞计数、白细胞计数和分类、血红蛋白。

③血液生化学指标：
肝脏功能：天门冬氨酸氨基转换酶(AST)、丙氨酸氨基转换酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TB)、白蛋白(ALB)、球蛋白/白蛋白比值(A/G)、总胆红素(T-BIL)。

肾功能：尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)。

其他：血糖(GLU)、总胆固醇(T-CHO)。

试验报告写明各项指标的检测方法，所用试剂盒的生产批号、规格等。

三、四类中药新药，如方中无毒性药材，急性毒性试验未发现明显毒性者，只是应检查肝肾功能各两项敏感指标。

④系统尸检和病理组织学检测
系统尸检：应全面细致，发现异常器官应种观点进行病理组织学检查。

脏器系数：解剖后取出心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、睾丸、子宫、脑和前列腺称重，计算脏器系数(脏器重量/体重)。

一二类中药新药需要测定上述全部脏器系数，三四类中药新药，如方中各味药材均符合法定标准，无毒性药材或有毒成分，按常规至少对心、肝、脾、肺、肾五个实质脏器称重，计算脏器系数。

病理组织学检查:a 取样：对照组和高剂量组动物及尸检异常者应取样详细检查，中剂量组和低剂量组也应取材放进10%福尔马林中固定保存，在高剂量组有异常时才进行检查。

b 检查内容：一类中药新药需查心、肾、肝、脾、肺、肾上腺、甲状腺、垂体、前列腺、胸腺、睾丸(连附睾)、卵巢、子宫、胃、十二指肠、回肠、结肠、胰腺、膀胱、淋巴结、脑、脊髓、胸骨(骨和骨髓)、视神经。

二三四类新药需查心、肝、肾、脾、肺、肾上腺、甲状腺、胃、胸腺、睾丸(连附睾)、前列腺、卵巢、子宫和可能的靶器官。

三、四类中药新药，如所用各味药材均符合法定标准、无毒性药材或毒性成分，简化对心、肝、脾、肺、肾五个实质脏器进行检查，在根据所含中药的性、味、功效、主治等不同情况相应增加检查脏器。

如苦寒药为主的新药应加胃、十二指肠；全方大寒，大热偏性明显者，加甲状腺、肾上腺和脑下垂体；祛风湿药和补益药应加胸腺、肾上腺。

⑤可逆性(恢复性观察)：最后一次给药24消失，每组活杀部分动物(2/3～1/2)检测各项指标，留下部分动物继续观察2～4周，再活杀检查，了解毒性反应的可逆程度和可能出现的延迟性毒性反应。

在此期间除不给受试药物外，观察内容与受试物期相同。

⑥检测指标的时间试验在3个月以内时，一般最后一次给药24消失和恢复结束时进行。

必要时，在试验中间检测指标一次。

试验大于3个月时，可在时间中间活杀少量动物(高剂量组和对照组)检测指标。

一般状况和症状的观察，每天观察一次，每周记录饲料消耗量和体重一次。

对濒死或死亡动物应及时检查。