第4章蛋白质的稳定性和稳定化

第三节 蛋白质的稳定化
一是如何防止蛋白质的可逆伸展， 可以开发出普遍适用的方法；
二是一旦酶发生了可逆伸展，如何 防止其不可逆失活反应的发生，对 此针对不同的失活原因采取不同的 特殊稳定化方法。
一. 固定化：
固定化稳定酶的因素：空间障碍、机械 方式的空间限制。
① 空间障碍：由于空间障碍可以防止蛋白水解酶的 作用，阻挡酶与化学失活剂的接触，同时阻碍氧 向酶的扩散可以保护对氧不稳定的酶。
Tm: 蛋白质受热伸展过渡中点时的 温度;
变性剂浓度: 蛋白质加变性剂伸展 过程中使蛋白质伸展一半时所需要 的变性剂浓度;
蛋白质失活的原因和机理
一．蛋白质水解酶和自溶作用
二．聚合作用:
蛋白质首先发生可逆性伸展,伸展的蛋 白质分子彼此缔合,以最大限度减少疏 水氨基酸暴露于水溶剂,最后可能发生 蛋白质分子间二硫键的形成,从而使蛋 白质沉淀析出.蛋白质的聚合作用可能 是不可逆的,并不一定是不可逆的.
② 机械方式: 使酶发生交联或包埋在载体紧密的孔 中可以使酶的构象更加坚牢，从而阻止酶构象从 折叠态向伸展态过渡。
空间限制引起的 表观稳定性
二．非共价修饰
反相胶束 添加剂:专一性底物及配体;非
专一性中性盐和多羟基物质; 与失活剂竞争的物质;除掉破 坏化学催化剂的物质 蛋白质间非共价相连
第四章 蛋白质的稳定性和稳定化
生命科学学院: 柯德森 Desenke@21cn.com
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研究意义:
了解蛋白质稳定性与结构的关系 是理解蛋白质分子自我装配过程 的关键.
研究蛋白质稳定性机制是实现酶 工程研究目标的重要基础.
第一节: 蛋白质的稳定性
一. 蛋白质稳定性的分子原因
三．化学修饰：
修饰作用可达到稳定酶的作用，得 到可溶性稳定化酶。
1. 可溶性大分子修饰酶： 聚乙二醇（PEG）、右旋糖苷、肝素等。
2. 小分子修饰酶
原因：
修饰有时会获得不同于天然蛋白质构象的更稳定 的构象；
修饰关键功能基团也会达到稳定化； 由化学修饰引入到蛋白质的新的功能基有可能形
表面活性剂在很低浓度下能使蛋白质发生强烈 的相互作用,导致蛋白质不可逆变性.其中阴离 子去污剂的作用比阳离子和非离子去污剂强烈.
六． 变性剂：
① 脲和盐酸胍:机制尚不明确,可能是消除了维持 三级结构的疏水作用力或直接与蛋白质分子作 用.
② 高浓度盐：高浓度盐既有稳定作用也有变性作 用，这要看盐的性质和浓度。
低蛋白质表面的疏水性,增加蛋白质内部的 疏水性
二. 测定蛋白质稳定性的方法
比较蛋白质稳定性的准则包括:
熔化温度Tm;蛋白质伸展一半时的 变性剂浓度
蛋白质自由能; 最大稳定性温度(Ts); 在特定温度下蛋白质功能活性维持
时间.
思考
熔化温度Tm和蛋白质伸展50% 时的变性剂浓度是预测酶稳定性 的最有用参数;
成附加氢键或盐键； 用非极性试剂修饰可加强蛋白质中疏水相互作用； 蛋白质表面基团的亲水性； 交联酶晶体
四．蛋白质工程：
用基因操纵技术高度专一性地改变目标蛋白质。
优点：提供了有目的改变酶性能的可能性，不仅来自百度文库变 酶的结构，也可以改变其催化活力及专一性和稳定性。
定点突变是其技术上的主要思路：
思考
聚合如果发生共价键就是不可逆的?
三． 极端pH: 活性中心氨基酸必需基团电离. pH的变化可以引起蛋白质的伸展,这个过程原
则上是可逆的,但这些变化常能导致不可逆的 聚合或酶的自溶,引起不可逆失活. 四． 氧化作用: 各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及 蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。分子氧、 H2O2和氧自由基是常见的蛋白质氧化剂。 五． 表面活性剂和去污剂
③ 螯合：常常不可逆地失活需要金属辅因子的酶， 但可稳定不需要金属辅因子的酶；
④ 有机溶剂：改变溶液的介电常数;增加疏水核 的溶解度,降低带电表面的溶解度;夺去酶分子 表面的必需水而使酶失活.
七． 重金属离子和巯基试剂:
与蛋白质的巯基、二硫键以及色氨酸、组氨酸残基反应。
八． 热:热失活是工业上最经常遇到的酶失活的原因.热失 活也分二步过程:伸展---不可逆失活.
① 工程二硫键；
② 增加蛋白质内部疏水性；
③ 酶表面的亲水化
④ 抗氧化失活；
⑤ Asn脱胺失活；
手段:同源杂色体交换?
思考题
什么叫蛋白质的稳定性?如何理解蛋白质的
稳定性这个概念?
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② 蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用 ③ 盐桥和氢键
④ 二硫键
⑤ 对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低
⑥ 氨基酸残基的坚实装配
⑦ 疏水相互作用(思考题)
疏水性标尺
疏水性氨基酸越多越稳定?
疏水性与蛋白质稳定性的关系小结
疏水性大小与稳定性没有必然的联系 非极性氨基酸在蛋白质球体内的规则的排
列是稳定性的原因之一 增加疏水作用是稳定蛋白质的实用方法:降
蛋白质的稳定性: 蛋白质抵抗各种 因素的影响,保持其生物活力的能 力.
蛋白质的特定功能是由其特定的 空间结构决定的,要保持其生物活
理解蛋白质 力,必须保持其空间结构,稳定蛋白 稳定性的概念?质空间结构的因素是什么?
维持蛋白结构稳定的主要因素:
① 金属离子、底物、辅因子和其他相对低分 子质量配体的结合作用
九． 机械力：
振动、剪切、超声波、压力都可能引起蛋白质的变性，这种 变性理论上是可逆的，但也可能伴随着其他反应而不可逆地 失活。
一○．冷冻和脱水：
冷冻和脱水时，溶质被浓缩，引起酶微环境中pH和离子强度 的剧烈改变，减弱疏水相互作用,并可能引起二硫交换和巯基 的氧化。
一一．辐射作用:
辐射可产生自由基(.OH,H2O2,O2-.等)直接或间接地作用于蛋 白质分子.
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