酵母菌发酵工艺

实验一、酵母细胞发酵实验

一、摘要

运用酵母、藻类和高等真菌等微生物进行工业化大规模培养得到其干细胞，并作为人类食品或动物饲料是工业生产中比较常用的方法。本实验课程以实验室小型发酵罐为发酵环境，以酵母菌为发酵对象，发酵生产饲料酵母。并且在发酵罐内没有染菌的情况下得到了115g的产品。

二、实验目的

1.学会一般培养基的制备原理、方法。

2.学会发酵过程中发酵液总糖含量及氨基氮等理化指标的常规检测方法。

3.掌握培养基及器皿的灭菌方法。

4.掌握酵母发酵工艺流程及具体操作方法。

三、实验内容

(一).斜面孢子的制备

于超净工作台面上，在火焰的保护下，用无菌接种棒挑取酵母菌少许于斜面培养基内，先划中线，后从下而上往两边划线均匀的铺开，塞好棉塞。扎好后，置于25~30℃恒温箱中培养（斜面朝下放），培养4~6天。

(二)摇瓶种子的制备

用接种棒刮下少量酵母菌，接种于摇瓶培养基内，置于摇床上，28℃、240r/min恒温培养24h。

(三)罐上各传感器的标定及发酵罐灭菌

1.罐内温度传感器的标定

100℃：取刚煮沸的水，将酒精温度计和传感器一同放入，静置一会儿，将罐温标定为温度计所示温度；

0℃：取适量冰水混合物，将酒精温度计和传感器一同放入，待温度计示数稳定后，将罐温标定为温度计所示温度。

2.水箱温度传感器的标定

步骤同1）。

3.DO电极“0”的标定

系统接通电源后，预热5min以上。取适量无水亚硫酸钠放入三角瓶内，并放入200mL 左右的自来水，摇动几下，保证为饱和溶液状态。将DO电极放入烧瓶内，稍后可见DO值下降，待5~10min后，将其值设为0。将电极取出，置于一旁。

4.在7L发酵罐中装入配好的发酵培养基（配料体积4L、消后体积4L）,先在夹套中通入蒸汽，将罐内温度预热至100℃，再通入饱和蒸汽对发酵罐进行实罐消毒，121℃、30min （罐压在0.12MPa左右），冷却后，通过滤空汽，并加以搅拌（100rpm），待DO值稳定后，即可标定100%的DO值。

5.将并瓶后的摇瓶种子在火焰的保护下接入发酵罐（接种量250mL），在控制条件（罐压：0.03~0.05MPa、罐温：28℃、DO值：50%以上、搅拌速率：100rpm以上，视发酵罐情况而定）下进行发酵。

6.每隔0.5h记录一次罐压、罐温、DO值、搅拌速率。

7.每隔6h取一次样（约20mL），留适量发酵液测pH值和镜检（美兰染色）用。其余过滤后取适量滤液测总糖含量、氨基氮含量。

总糖测定步骤

实验：

实验组：

①取1mL滤液于150mL三角瓶中

②加入10mL 3mol/L的盐酸液

③电炉加热至沸腾后保持3min（用晓烧杯盖住瓶口）

④冷却后加入3mol/L NaOH溶液中和

⑤准确加入20mL混合铜试剂，电炉加热沸腾后保持3min

⑥取出冷却后加2mol/L 硫酸15mL

⑦立即以0.1mol/L Na2S2O3标准液滴定溶液至淡黄色

⑧加1%淀粉指示剂1mL，继续滴定至蓝色消退

⑨读取Na2S2O3消耗的体积数。

空白组：

另取蒸馏水5mL于三角瓶中，加混合铜试剂20mL，于电炉上加热至沸腾后，保持3min，冷却后加入2mol/L硫酸15mL，立即以0.1mol/L Na2S2O3标准液滴定溶液至淡黄色，加1%淀粉指示剂1mL，继续滴定至蓝色消退，读取Na2S2O3消耗的体积数。

计算：

样品浓度（%）=（标准葡萄糖浓度（%）/（V

空白-V

标准

））*（V

空白

-V

样品

）

氨基氮测定步骤

①吸取滤液5mL于三角瓶中，并加蒸馏水50mL

②滴加2~4滴甲基红（3滴）

③滴加0.1mol/L硫酸液至红色不再消失

④用0.0747mol/L氢氧化钠滴至红色刚退

⑤加入18%的中性甲醛5mL，摇匀

⑥加入1mL酚酞指示剂

⑦记下此时滴定管示数，用0.0747mol/L氢氧化钠滴定至酚酞刚显红色

⑧记下滴管示数。

⑨计算：N（mg/100mL）=MNaOH（mol/L）*VNaOH/吸样毫升数*100%。

（四）罐上的工艺控制

1）预热：打开夹套蒸汽进汽阀，微开排污阀，将罐温加热至100℃

2）灭菌：关闭夹套蒸汽进汽阀，开启蒸汽进罐阀，使罐温升至121℃；打开空气管路蒸汽阀门对空气过滤器进行灭菌；调整蒸汽进罐阀、排气阀的开度使罐压保持在0.12MPa 左右（如此时温度与121℃相差较大，则可用121℃重新标定罐内温度）；保持30min；关闭所有蒸汽阀门，让罐压下降至0.01MPa，打开空气进气阀，引无菌空气保压（0.03~0.05MPa），确保罐压小于过滤器空气压。

3）发酵准备阶段：开启冷却模式，开启进水阀，快速降温至28℃；退出冷却模式，开启发酵模式，保温运作；开启搅拌器（100rpm），如果排气阀没有过度的逃液，则可加大搅拌速率，或加大空气进气量。

4）发酵：采用火焰法接种，调节排气阀、进气阀开度，还有搅拌器速率，在不过分逃液的前提下，保持较高的DO值；发酵过程中微开取样管路（蒸汽进罐阀紧闭）保持较小的蒸汽排出（时刻保持取样管路无菌）。

5）取样：关闭蒸汽排出阀，关闭蒸汽进汽阀，开启蒸汽排出阀，开启蒸汽进罐阀，并调节该两阀门的开度使发酵液以适宜的流量流出，用三角瓶接约20mL；关闭蒸汽进罐阀门，开启蒸汽进汽阀。

6）放罐：关闭空气进气管路，开启夹套加热管路，关闭冷凝水管路，关闭蒸汽排出阀，引蒸汽进罐，待罐温升至100℃后，计时3min；关闭蒸汽进罐阀，关闭蒸汽进汽阀；开启

空气进气管路，开启蒸汽进罐阀，利用压强将液体放出；放完后，关闭空气进气管路；通自

来水按以上步骤洗罐3次；通入自来水，待下次发酵开始。

四、仪器设备

小型发酵系统一套（3罐）、茄子瓶若干、接种棒若干、各规格三角瓶若干、各量程移液管若干、吸耳球若干、各规格烧杯若干、玻璃搅拌棒若干、铁桶若干、滴定管、铁架台、

电炉、显微镜、电子称、灭菌锅。

五、材料与试剂

酵母菌、无水亚硫酸钠、混合铜试剂、0.1mol/L Na2S2O3溶液、3mol/L的盐酸液、3mol/L NaOH溶液、2mol/L 硫酸、1%淀粉指示剂、甲基红染色剂、0.1mol/L硫酸、0.0747mol/L

氢氧化钠、18%的中性甲醛、酚酞指示剂。

六、实验步骤

发酵准备阶段：

1）制备茄子瓶培养基，并灭菌备用；配各种试剂

2）将酵母菌接种于茄子瓶中培养7d

3）配种子培养基，并灭菌；接酵母菌于各种子培养基中，摇床恒温培养24h

4）配发酵培养液；将发酵罐擦拭干净，倒入发酵液；预热、灭菌，冷却后备用；将各种子培养基并为一瓶，将菌液在火焰的保护下接入罐内，开始发酵。

发酵阶段：

1）看罐，保持罐压：0.03~0.05MPa、罐温：28℃、DO值：50%以上、搅拌速率：100rpm 以上

2）每隔0.5h记录以上参数

3）每隔6h取样一次，并测pH值总糖含量、氨基氮含量，并镜检

发酵结束：

1）放罐

2）洗发酵罐

七、实验数据的处理与分析

原始数据记录批

接种系统1000ml菌液搅拌情况80r/min 配料体积4L 消后体积1300ml 培养时间0h 6h 12h 18h 24h 30h 36h 42h 48h 54h 60h 66h

取样时间19:20 1:20 7:20 13:20 19:20 1:20 7:20 13:20 19:20 1:20 7:20 13:20

3.227

4.470 4.26 1.97 1.335 3.334 0.632 0.685 3.065 3.459 0.676 0.525 总糖

g/100ml

氨基氮

58.57 41.82 51.24 33.47 51.24 46.06 39.32 32.42 19.03 49.15 41.83 27.19 mg/100ml

罐压MPa 0.05 0.039 0.038 0.038 0.034 0.036 0.035 0.033 0.044 0.035 0.048 0.046 罐温19 24.3 22.2 22.2 29.3 28.0 21.6 28.3 25.4 26.4 28.8 21.8