铜绿假单胞菌操作规程
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5.2.3.2软膏、乳膏剂取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml,振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其层作为1：10的供试液。
5.3具抑菌活性的供试品
5.3.3.1取滤膜孔径不大于0.45µm，直径不小于50mm可拆卸的滤器。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法进行灭菌。使用时，必须保证滤膜在过滤前后的完整性。
5.3.3.2水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，冲洗次数为3次。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。
5.3.3.3每张滤膜取相当于1g或1ml供试品的供试液直接过滤，或加至适量稀释剂中，混匀，过滤。若供试品1g或1ml含菌较多，可选适宜稀释级的供试液1ml，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其它适宜的冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，冲洗次数为3次。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼胆培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。滤膜贴于平板上时不得有空隙.10.1%苯扎溴铵溶液（供洗手、擦拭操作台面用）。
2.1.25%石碳酸溶液（配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用）亦可选用其他适宜消毒液。
2.1.375%乙醇溶液。
2.2稀释剂和试剂
2.2.1PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液
2.2.2 0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液
铜绿假单胞菌检验操作规程
题目：铜绿假单胞菌检验操作规程
编码：
起草：
日期：
审核：
日期：
批准：
日期：
生效日期：
颁发部门：质控部
分发部门：检验室
变更记载修改号
批准日期执行日期
变更原因及目的
标准依据：中国药典2005版二部。
目的：建立一个铜绿假单胞菌检验的操作规程。
范围：本规程适用于铜绿假单胞菌的检验。
职责：检验者、质管部长对本规程的实施负责
5．操作方法
5.1试验前的准备：
5.1.1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀释剂等移至无菌室内。每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。
5.1.2开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于30min。
（Φ90mm），量筒（100ml），试管（18×180mm）及塞，吸管（1ml分度
0.01，10ml分度0.1），载玻片，盖玻片。
1.11用具：大小橡皮头、无菌衣、帽、口罩、手套、酒精灯、酒精棉球、灭菌
剪刀、镊子、称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、陶瓦盖（Φ12cm）、不锈钢盘（或陶瓷盘）。
5.2.2固体、半固体或黏稠液供试品取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪（3000～5000r/min、2～4min）或其他有效的方法，混匀，作为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
5.2.3非水溶性供试品
5.2.3.1软膏、乳膏剂先将已备妥灭菌的含司盘80 5g、单硬脂酸甘油脂3g、聚山梨脂80 10g的混合物融化，待冷至45℃时，加入供试品5g（或5ml），立即用玻棒搅拌均匀，分次少量慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液80ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1﹕20供试液。
5.3.2离心沉淀集菌法取规定量的供试液，3000r/min，离心20min，弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释剂至原规定量。如供试液中有不溶颗粒、沉淀，先以500r/min，离心5min，留离心沉淀物，取全部上清液按上述高速再离心，留底部集菌液约2min，加稀释剂至原规定量。
5.3.3薄膜过滤法
2.2.3 1%盐酸二甲基对苯二胺试液
2.2.4盐酸试液
2.2.5氯仿
3．培养基
3.1营养肉汤培养基
3.2胆盐乳糖（BL）培养基
3.3营养琼脂培养基
3.4溴代十六烷基三甲胺
3.5绿脓菌素测定用培养基（PDP琼脂）
3.6明胶培养基
3.7硝酸盐胨水培养基
4．对照用菌液
铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，于36±1℃培养18~24h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1：106，使对照菌加入量含菌10~100个（一般用量为0.1ml），菌数在做阳性对照实验的同时营养琼脂平板涂布经培养后计数确定。
5.1.3操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。
5.1.4操作前先用酒精棉球擦手，再用酒精棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌手术剪或镊将供试品启封。
5.2供试液的制备：
5.2.1液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml。可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。
当供试品具有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下：
5.3.1稀释法取规定量的供试液，加至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。用平板法测定菌数时，1ml供试液可等量分注多个平皿；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。培养基稀释法适用于抑菌作用不强的制剂。
规程：
1．仪器、设备和用具
1.1净化工作台
1.2恒温培养箱（36±1℃）
1.3高压蒸汽灭菌器
1.4显微镜（1500×）
1.5微波炉或其他适宜加热装置
1.6水浴箱45±1℃
1.7离心机（500~4000/min）
1.8薄膜过滤装置微孔滤膜直径约50mm，孔径0.45±0.02um
1.9电冰箱
1.10玻璃器皿：锥形瓶（250～300ml），培养皿
5.3具抑菌活性的供试品
5.3.3.1取滤膜孔径不大于0.45µm，直径不小于50mm可拆卸的滤器。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法进行灭菌。使用时，必须保证滤膜在过滤前后的完整性。
5.3.3.2水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，冲洗次数为3次。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。
5.3.3.3每张滤膜取相当于1g或1ml供试品的供试液直接过滤，或加至适量稀释剂中，混匀，过滤。若供试品1g或1ml含菌较多，可选适宜稀释级的供试液1ml，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其它适宜的冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，冲洗次数为3次。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼胆培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。滤膜贴于平板上时不得有空隙.10.1%苯扎溴铵溶液（供洗手、擦拭操作台面用）。
2.1.25%石碳酸溶液（配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用）亦可选用其他适宜消毒液。
2.1.375%乙醇溶液。
2.2稀释剂和试剂
2.2.1PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液
2.2.2 0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液
铜绿假单胞菌检验操作规程
题目：铜绿假单胞菌检验操作规程
编码：
起草：
日期：
审核：
日期：
批准：
日期：
生效日期：
颁发部门：质控部
分发部门：检验室
变更记载修改号
批准日期执行日期
变更原因及目的
标准依据：中国药典2005版二部。
目的：建立一个铜绿假单胞菌检验的操作规程。
范围：本规程适用于铜绿假单胞菌的检验。
职责：检验者、质管部长对本规程的实施负责
5．操作方法
5.1试验前的准备：
5.1.1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀释剂等移至无菌室内。每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。
5.1.2开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于30min。
（Φ90mm），量筒（100ml），试管（18×180mm）及塞，吸管（1ml分度
0.01，10ml分度0.1），载玻片，盖玻片。
1.11用具：大小橡皮头、无菌衣、帽、口罩、手套、酒精灯、酒精棉球、灭菌
剪刀、镊子、称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、陶瓦盖（Φ12cm）、不锈钢盘（或陶瓷盘）。
5.2.2固体、半固体或黏稠液供试品取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪（3000～5000r/min、2～4min）或其他有效的方法，混匀，作为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
5.2.3非水溶性供试品
5.2.3.1软膏、乳膏剂先将已备妥灭菌的含司盘80 5g、单硬脂酸甘油脂3g、聚山梨脂80 10g的混合物融化，待冷至45℃时，加入供试品5g（或5ml），立即用玻棒搅拌均匀，分次少量慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液80ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1﹕20供试液。
5.3.2离心沉淀集菌法取规定量的供试液，3000r/min，离心20min，弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释剂至原规定量。如供试液中有不溶颗粒、沉淀，先以500r/min，离心5min，留离心沉淀物，取全部上清液按上述高速再离心，留底部集菌液约2min，加稀释剂至原规定量。
5.3.3薄膜过滤法
2.2.3 1%盐酸二甲基对苯二胺试液
2.2.4盐酸试液
2.2.5氯仿
3．培养基
3.1营养肉汤培养基
3.2胆盐乳糖（BL）培养基
3.3营养琼脂培养基
3.4溴代十六烷基三甲胺
3.5绿脓菌素测定用培养基（PDP琼脂）
3.6明胶培养基
3.7硝酸盐胨水培养基
4．对照用菌液
铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，于36±1℃培养18~24h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1：106，使对照菌加入量含菌10~100个（一般用量为0.1ml），菌数在做阳性对照实验的同时营养琼脂平板涂布经培养后计数确定。
5.1.3操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。
5.1.4操作前先用酒精棉球擦手，再用酒精棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌手术剪或镊将供试品启封。
5.2供试液的制备：
5.2.1液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml。可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。
当供试品具有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下：
5.3.1稀释法取规定量的供试液，加至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。用平板法测定菌数时，1ml供试液可等量分注多个平皿；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。培养基稀释法适用于抑菌作用不强的制剂。
规程：
1．仪器、设备和用具
1.1净化工作台
1.2恒温培养箱（36±1℃）
1.3高压蒸汽灭菌器
1.4显微镜（1500×）
1.5微波炉或其他适宜加热装置
1.6水浴箱45±1℃
1.7离心机（500~4000/min）
1.8薄膜过滤装置微孔滤膜直径约50mm，孔径0.45±0.02um
1.9电冰箱
1.10玻璃器皿：锥形瓶（250～300ml），培养皿