扩增活化的自体淋巴细胞技术
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
裸鼠注射EAAL细胞的剂量分组
注射渠道 组别 G1 G2 G3 G4 阴性对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 微静脉 微静脉 微静脉 微静脉 注射剂量 (细胞数/只) 0 1.7 × 105 5 × 105 15 × 105 注射液量 (ml) 0.3 0.3 0.3 0.3 每组裸鼠数量 (个体号) 10 (1M01 – 1M10) 10 (2M11 – 2M20) 10 (3M21 – 3M30) 10 (4M31 – 4M40) 每组肿瘤 平均体积（mm3 ） 1444.69 1236.45 979.91 941.39 每组肿瘤 平均重量（g ） 0.96 0.82 0.73 0.72
IL-5 TNF-a
IL-2
IFN
IL-4
IL-5
TNF
b-actin
Figure 5. Cytokine gene expression by ex vivo-expanded T cells. Expanded CyT cells were re-stimulated with PHA (1 and 5 mg/ml) for 4 hr and total RNA was extracted from the cells and the gene expression levels of IL-2, IFN-g, IL-4, IL-5, and TNF-a were analyzed by RTPCR (A). Band areas were analyzed using an image analysis systems (Multi-Analyst, Bio-Rad, CA), and data were presented as ratios vs. bactin, which served as an internal control (B). Representative image from sample #4 was shown.
25
50
CD3+CD8-IFN-g+
P=0.0079
20
40
Percentage
Percentage
15
30
10
20
5
10
0
0
PRE
POST
PRE
POST
The change of the ratio of IFN-gamma+ cells
EAAL的疗效
• 单独使用
–手术后预防复发 –稳定肿瘤 –改善生活质量
Percentage
Percentage
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
PRE
POST
PRE
POST
IFN-g+
***P=0.0005
100
75
Percentage
50
25
0
PRE
POST
The subsets of IFN-gamma+ lymphocytes
CD3+IFN-γ +
6.59 0.39 0.25 0.64 0.45 0.28 0.62 0.52 0.25 0.48
2.57
2.99 0.07 1.15 16.43 0.06 0.36 6.00 0.15 0.22 1.47
2.3
7.19 0.1 0.51 5.10 0.07 0.36 5.14 0.23 0.48 2.09
EAAL 扩增活化的自体淋巴细胞 治疗肿瘤技术简介
Introduction of EAAL Therapy
肿瘤免疫治疗的机制
Mechanisms of Cancer Immunotherapy
• 通过调动机体自身的免疫系统，达到控制肿
瘤生长，杀伤肿瘤细胞的目的。
• 前提：
–肿瘤细胞有别于正常细胞 • 肿瘤抗原 • 肿瘤特异性T细胞免疫应答 • 肿瘤特异性抗体免疫应答 • 天然免疫对肿瘤细胞的杀伤作用
•
结果：
– 获得了6年无复发生存，整个过程没有出现治疗相关的不良反应。在长期观察中，该患者健康 状况良好，未出现肝癌的复发，且肝功能好转。
左眼睑细胞鳞癌和结肠腺癌双原发
（Jpn J Clin Oncol 2000:30(6)267-271 ）
• 患者：
– 同时患有左眼睑细胞鳞癌和结肠腺癌，两者都已出现淋巴结转移。患 者接受了左眼剜除术及左颈部改良根治性淋巴结清扫术和随后的跨结
肿瘤疫苗
过继细胞免疫治疗
细胞免疫治疗
Cellular Immunotherapy
• •
包括肿瘤在内的多种慢性病的最重要的生物治疗方法之一 肿瘤的细胞免疫治疗： – 非特异性 ※ LAK细胞 ※ CIK细胞 ※ EAAL细胞 – 特异性 ※ Provenge,树突状细胞 ※ 肿瘤特异性T细胞
其它慢性病的细胞免疫治疗： ※慢性病毒感染性疾病 乙肝、丙肝 艾滋病 ※慢性寄生虫感染 ※糖尿病 ※多发性硬化症 ※系统性红斑狼疮
G5
阳性对照组
腹腔
2 mg/kg
10 ml/kg
10 (4M41 – 4M50)
847.92
0.64
p < 0.05
G2 G1
G3
G5
G4
EAAL对患者体内免疫环境的改变作用
1. 2. 3. 4. 5. CD8+ 杀伤性T淋巴细胞比例上升 NK细胞比例上升 CD4/CD8 T淋巴细胞比值下降 分泌的IFN-γ细胞比例上升 IFN-γ的分泌量上升
经EAAL治疗后，患者体内杀伤性淋巴细胞数量和比 例显著增加
EAAL为CD8+ T细胞为主
细胞表面分子 培养前的百分比 （均值）
CD3 CD4 CD8 CD4/CD8 CD3+CD56+ CD3-CD16+ CD4+CD25+ 65.0 33.2 22.8 1.9 5.4 12.6 3.3
培养后的百分比 （均值）
肠切除术和局部淋巴结清扫。
MAGE-1
AC(%) Multiple BC(%)
MAGE-3
AC(%) Multiple BC(%)
MAGE-10
AC(%) Multiple
BC(%)
P53 AC(%) Multiple BC(%) HIV AC(%) Multiple BC(%) FLU AC(%) Multiple
0.63
CD3+CD8+
P=0.0036
50
40
Percentage
30
20
10
0
PRE
POST
CD3-CD56+
50
P=0.0485
PRE
40
Percentage
30
POST
20
10
0
PRE
POST
CD4/CD8
P=0.0333
7 6 5 4 3 2 1 0
CD3+CD4+
65 60 55 50
P=0.5278
x
Q DDP+EAAL 88.1±0.64* 88.9±0.16* 96.7±1.99* 55.8±0.33* 73.6±0.67* 66.2±0.12* 53.2±0.14* 1.602 1.732 2.080 1.424 2.297 2.169 1.885
EAAL 16.6±0.4 16.6±0.4 16.6±0.4 16.6±0.4 16.6±0.4 16.6±0.4 16.6±0.4
83.7 10.6 63.0 0.2 11.7 11.8 1.7
EAAL细胞分泌Th1类细胞因子
A
IL-2 PHA
0
1
5 (mg/ml)
B
IFN-g
1800 1500
untreated 1 mg/ml PHA 5 mg/ml PHA
IL-4
Ratios tob-actin
1200 900 600 300 0
• 与化疗/靶向治疗联合
–协同作用 –改善化疗和靶向治疗副作用
• 延长患者的总生存期
EAAL的疗效：降低肝癌手术后的复发率： 随机对照临床实验结果
術 後 复 发
期間
5年以内复发 2年以内复发
免疫群（76例）（＊）
45(59%) 25(33%)
対照群（74例）
57(77%) 40(54%)
ｐ値（＊＊）
P=0.0060 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
PRE POST
65 60 55 50
Baidu NhomakorabeaCD3-IFN-g+
P=0.0145
Percentage
Percentage
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
PRE
POST
CD3+CD8+IFN-g+
P=0.0269
0.01 0.005
（LANCET 2000;356;802-07）
一例晚期肝癌患者实现6年带瘤生存 Hepatology (28),5,1436-7,1998.
• 患者：
– 62岁，男性，丙肝，肝癌Child B级，约7厘米大小。已出现右门静脉肿瘤栓塞和右肾转移（ T4N0M1,ⅣB期）该肿瘤已无法切除。该患者因此接受了质子照射治疗，治疗后肿瘤出现坏死 并且体积缩小至原来的50%。
(注：联合作用组、单顺铂组和单淋巴细胞作用组抑制率进行单因素方差分析,P<0.01 *)
EAL细胞的肿瘤抗原特异性分析
Donor A2-01 Cancer Antigen BC(%) 0.17 0.86 0.32 A2-02 A2-03
NY-ESO-1
AC(%)
Multiple BC(%)
1.12
5.27 8.37 0.59 0.24 0.41 1.06 4.44 4.19
1.13
12.24 10.83 0.2 0.25 1.25 0.6 11.76 19.60
0.78
8.7 11.15 0.22 0.31 1.41 0.66 10.01 15.17
EAAL在裸鼠体内 对HepG2形成肿瘤的抑制作用
扩增活化的自体淋巴细胞（EAAL）的定义
• • • •
自体免疫细胞治疗技术 CD3+ T淋巴细胞为主（95.91%±0.24% ），含少量NK细胞 体外扩增活化 肿瘤杀伤功能
• 改进的LAK和CIK治疗：细胞培养效率和肿瘤杀伤能力显著增强
• EAAL是Expanded Activated Autologous Lymphocytes（扩增活化的自体 淋巴细胞）的简称。其定义是通过采取机体自身20-100ml静脉血，分离 获得0.8-3 x 107外周血单个核细胞，经过体外无血清培养基培养，获得 以CD3细胞为主的，包含CD8+ T淋巴细胞、CD4+ T淋巴细胞、CD3+CD56+ NKT细胞、NK细胞， 细胞数量在3 x 109以上的活化的混合淋巴细胞，这 些细胞在体外具有明确肿瘤杀伤功能。
EAAL技术特点
使用无血清淋巴细胞培养基进行细胞培养，保证没有潜在的病源微生物感染 细胞扩增的高效性和高活性:扩增效率约为2001000倍
不需使用单采机，对患者免疫系统没有破坏作用
独特的细胞培养工艺，少量外周血即可满足多次细胞回输的要求
可与化疗联合，完全满足多个化疗疗程对细胞治疗次数和细
胞治疗数目的要求，从而产生较好的协同治疗肿瘤效果。
•
EAAL治疗：
– – – – – – 放射治疗之后 患者每1－2月应用一次过继性免疫治疗 平均每次回输细胞1.4±0.5×10（10） 绝大多数为T细胞标记阳性（95%±2% CD3+，90％±2%CD3+/HLA-DR+，61%±9% CD8+ ，39%±8% CD4+）且对Daudi细胞具有细胞毒活性的细胞。 细胞回输在6年内共为53次完成（平均5-6周一次回输） 累计回输细胞总数为7.3×10（11）
如何达到有效的免疫治疗效果
• 有足够可以识别肿瘤抗原的杀伤性T细胞 • 机体的免疫环境有利于上述细胞发挥抗肿瘤功能
– Th1/Th2 – Treg
• 这些T细胞可以到达肿瘤组织局部
– T 细胞归巢
• 在肿瘤局部，这些T细胞可以发挥有效的杀伤功能
– 肿瘤基质及肿瘤组织微环境
肿瘤的免疫治疗方法
Approches of Cancer Immunotherapy
EAL联合化疗的体外杀伤效果
培养后的淋巴细胞与顺铂以不同序贯方式联合对PLA-801D细胞的抑制率
inhibited rates(%) Group 淋巴细胞作用前10h顺铂 淋巴细胞作用前8h顺铂 淋巴细胞作用前4h顺铂 淋巴细胞作用同时顺铂 淋巴细胞作用后4h顺铂 淋巴细胞作用后8h顺铂 淋巴细胞作用后10h顺铂 DDP 46±1.7 41.7±3.0 35.8±1.3 27.1±2.4 18.5±1.3 16.7±2.2 14.0±0.9
可进行多次、高频治疗，达到最好的治疗效果
EAAL技术的临床-实验室操作流程 Manufacturing process of Immunecell-LC
外周血 20-100ml
回输 100ml/次，1-8次
收集诱导的 杀伤细胞 扩增及活化
培养及扩增14-35天
16
EAAL的作用机制研究
自体肿瘤细胞的体外杀伤效应（IFN-γ）
注射渠道 组别 G1 G2 G3 G4 阴性对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 微静脉 微静脉 微静脉 微静脉 注射剂量 (细胞数/只) 0 1.7 × 105 5 × 105 15 × 105 注射液量 (ml) 0.3 0.3 0.3 0.3 每组裸鼠数量 (个体号) 10 (1M01 – 1M10) 10 (2M11 – 2M20) 10 (3M21 – 3M30) 10 (4M31 – 4M40) 每组肿瘤 平均体积（mm3 ） 1444.69 1236.45 979.91 941.39 每组肿瘤 平均重量（g ） 0.96 0.82 0.73 0.72
IL-5 TNF-a
IL-2
IFN
IL-4
IL-5
TNF
b-actin
Figure 5. Cytokine gene expression by ex vivo-expanded T cells. Expanded CyT cells were re-stimulated with PHA (1 and 5 mg/ml) for 4 hr and total RNA was extracted from the cells and the gene expression levels of IL-2, IFN-g, IL-4, IL-5, and TNF-a were analyzed by RTPCR (A). Band areas were analyzed using an image analysis systems (Multi-Analyst, Bio-Rad, CA), and data were presented as ratios vs. bactin, which served as an internal control (B). Representative image from sample #4 was shown.
25
50
CD3+CD8-IFN-g+
P=0.0079
20
40
Percentage
Percentage
15
30
10
20
5
10
0
0
PRE
POST
PRE
POST
The change of the ratio of IFN-gamma+ cells
EAAL的疗效
• 单独使用
–手术后预防复发 –稳定肿瘤 –改善生活质量
Percentage
Percentage
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
PRE
POST
PRE
POST
IFN-g+
***P=0.0005
100
75
Percentage
50
25
0
PRE
POST
The subsets of IFN-gamma+ lymphocytes
CD3+IFN-γ +
6.59 0.39 0.25 0.64 0.45 0.28 0.62 0.52 0.25 0.48
2.57
2.99 0.07 1.15 16.43 0.06 0.36 6.00 0.15 0.22 1.47
2.3
7.19 0.1 0.51 5.10 0.07 0.36 5.14 0.23 0.48 2.09
EAAL 扩增活化的自体淋巴细胞 治疗肿瘤技术简介
Introduction of EAAL Therapy
肿瘤免疫治疗的机制
Mechanisms of Cancer Immunotherapy
• 通过调动机体自身的免疫系统，达到控制肿
瘤生长，杀伤肿瘤细胞的目的。
• 前提：
–肿瘤细胞有别于正常细胞 • 肿瘤抗原 • 肿瘤特异性T细胞免疫应答 • 肿瘤特异性抗体免疫应答 • 天然免疫对肿瘤细胞的杀伤作用
•
结果：
– 获得了6年无复发生存，整个过程没有出现治疗相关的不良反应。在长期观察中，该患者健康 状况良好，未出现肝癌的复发，且肝功能好转。
左眼睑细胞鳞癌和结肠腺癌双原发
（Jpn J Clin Oncol 2000:30(6)267-271 ）
• 患者：
– 同时患有左眼睑细胞鳞癌和结肠腺癌，两者都已出现淋巴结转移。患 者接受了左眼剜除术及左颈部改良根治性淋巴结清扫术和随后的跨结
肿瘤疫苗
过继细胞免疫治疗
细胞免疫治疗
Cellular Immunotherapy
• •
包括肿瘤在内的多种慢性病的最重要的生物治疗方法之一 肿瘤的细胞免疫治疗： – 非特异性 ※ LAK细胞 ※ CIK细胞 ※ EAAL细胞 – 特异性 ※ Provenge,树突状细胞 ※ 肿瘤特异性T细胞
其它慢性病的细胞免疫治疗： ※慢性病毒感染性疾病 乙肝、丙肝 艾滋病 ※慢性寄生虫感染 ※糖尿病 ※多发性硬化症 ※系统性红斑狼疮
G5
阳性对照组
腹腔
2 mg/kg
10 ml/kg
10 (4M41 – 4M50)
847.92
0.64
p < 0.05
G2 G1
G3
G5
G4
EAAL对患者体内免疫环境的改变作用
1. 2. 3. 4. 5. CD8+ 杀伤性T淋巴细胞比例上升 NK细胞比例上升 CD4/CD8 T淋巴细胞比值下降 分泌的IFN-γ细胞比例上升 IFN-γ的分泌量上升
经EAAL治疗后，患者体内杀伤性淋巴细胞数量和比 例显著增加
EAAL为CD8+ T细胞为主
细胞表面分子 培养前的百分比 （均值）
CD3 CD4 CD8 CD4/CD8 CD3+CD56+ CD3-CD16+ CD4+CD25+ 65.0 33.2 22.8 1.9 5.4 12.6 3.3
培养后的百分比 （均值）
肠切除术和局部淋巴结清扫。
MAGE-1
AC(%) Multiple BC(%)
MAGE-3
AC(%) Multiple BC(%)
MAGE-10
AC(%) Multiple
BC(%)
P53 AC(%) Multiple BC(%) HIV AC(%) Multiple BC(%) FLU AC(%) Multiple
0.63
CD3+CD8+
P=0.0036
50
40
Percentage
30
20
10
0
PRE
POST
CD3-CD56+
50
P=0.0485
PRE
40
Percentage
30
POST
20
10
0
PRE
POST
CD4/CD8
P=0.0333
7 6 5 4 3 2 1 0
CD3+CD4+
65 60 55 50
P=0.5278
x
Q DDP+EAAL 88.1±0.64* 88.9±0.16* 96.7±1.99* 55.8±0.33* 73.6±0.67* 66.2±0.12* 53.2±0.14* 1.602 1.732 2.080 1.424 2.297 2.169 1.885
EAAL 16.6±0.4 16.6±0.4 16.6±0.4 16.6±0.4 16.6±0.4 16.6±0.4 16.6±0.4
83.7 10.6 63.0 0.2 11.7 11.8 1.7
EAAL细胞分泌Th1类细胞因子
A
IL-2 PHA
0
1
5 (mg/ml)
B
IFN-g
1800 1500
untreated 1 mg/ml PHA 5 mg/ml PHA
IL-4
Ratios tob-actin
1200 900 600 300 0
• 与化疗/靶向治疗联合
–协同作用 –改善化疗和靶向治疗副作用
• 延长患者的总生存期
EAAL的疗效：降低肝癌手术后的复发率： 随机对照临床实验结果
術 後 复 发
期間
5年以内复发 2年以内复发
免疫群（76例）（＊）
45(59%) 25(33%)
対照群（74例）
57(77%) 40(54%)
ｐ値（＊＊）
P=0.0060 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
PRE POST
65 60 55 50
Baidu NhomakorabeaCD3-IFN-g+
P=0.0145
Percentage
Percentage
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
PRE
POST
CD3+CD8+IFN-g+
P=0.0269
0.01 0.005
（LANCET 2000;356;802-07）
一例晚期肝癌患者实现6年带瘤生存 Hepatology (28),5,1436-7,1998.
• 患者：
– 62岁，男性，丙肝，肝癌Child B级，约7厘米大小。已出现右门静脉肿瘤栓塞和右肾转移（ T4N0M1,ⅣB期）该肿瘤已无法切除。该患者因此接受了质子照射治疗，治疗后肿瘤出现坏死 并且体积缩小至原来的50%。
(注：联合作用组、单顺铂组和单淋巴细胞作用组抑制率进行单因素方差分析,P<0.01 *)
EAL细胞的肿瘤抗原特异性分析
Donor A2-01 Cancer Antigen BC(%) 0.17 0.86 0.32 A2-02 A2-03
NY-ESO-1
AC(%)
Multiple BC(%)
1.12
5.27 8.37 0.59 0.24 0.41 1.06 4.44 4.19
1.13
12.24 10.83 0.2 0.25 1.25 0.6 11.76 19.60
0.78
8.7 11.15 0.22 0.31 1.41 0.66 10.01 15.17
EAAL在裸鼠体内 对HepG2形成肿瘤的抑制作用
扩增活化的自体淋巴细胞（EAAL）的定义
• • • •
自体免疫细胞治疗技术 CD3+ T淋巴细胞为主（95.91%±0.24% ），含少量NK细胞 体外扩增活化 肿瘤杀伤功能
• 改进的LAK和CIK治疗：细胞培养效率和肿瘤杀伤能力显著增强
• EAAL是Expanded Activated Autologous Lymphocytes（扩增活化的自体 淋巴细胞）的简称。其定义是通过采取机体自身20-100ml静脉血，分离 获得0.8-3 x 107外周血单个核细胞，经过体外无血清培养基培养，获得 以CD3细胞为主的，包含CD8+ T淋巴细胞、CD4+ T淋巴细胞、CD3+CD56+ NKT细胞、NK细胞， 细胞数量在3 x 109以上的活化的混合淋巴细胞，这 些细胞在体外具有明确肿瘤杀伤功能。
EAAL技术特点
使用无血清淋巴细胞培养基进行细胞培养，保证没有潜在的病源微生物感染 细胞扩增的高效性和高活性:扩增效率约为2001000倍
不需使用单采机，对患者免疫系统没有破坏作用
独特的细胞培养工艺，少量外周血即可满足多次细胞回输的要求
可与化疗联合，完全满足多个化疗疗程对细胞治疗次数和细
胞治疗数目的要求，从而产生较好的协同治疗肿瘤效果。
•
EAAL治疗：
– – – – – – 放射治疗之后 患者每1－2月应用一次过继性免疫治疗 平均每次回输细胞1.4±0.5×10（10） 绝大多数为T细胞标记阳性（95%±2% CD3+，90％±2%CD3+/HLA-DR+，61%±9% CD8+ ，39%±8% CD4+）且对Daudi细胞具有细胞毒活性的细胞。 细胞回输在6年内共为53次完成（平均5-6周一次回输） 累计回输细胞总数为7.3×10（11）
如何达到有效的免疫治疗效果
• 有足够可以识别肿瘤抗原的杀伤性T细胞 • 机体的免疫环境有利于上述细胞发挥抗肿瘤功能
– Th1/Th2 – Treg
• 这些T细胞可以到达肿瘤组织局部
– T 细胞归巢
• 在肿瘤局部，这些T细胞可以发挥有效的杀伤功能
– 肿瘤基质及肿瘤组织微环境
肿瘤的免疫治疗方法
Approches of Cancer Immunotherapy
EAL联合化疗的体外杀伤效果
培养后的淋巴细胞与顺铂以不同序贯方式联合对PLA-801D细胞的抑制率
inhibited rates(%) Group 淋巴细胞作用前10h顺铂 淋巴细胞作用前8h顺铂 淋巴细胞作用前4h顺铂 淋巴细胞作用同时顺铂 淋巴细胞作用后4h顺铂 淋巴细胞作用后8h顺铂 淋巴细胞作用后10h顺铂 DDP 46±1.7 41.7±3.0 35.8±1.3 27.1±2.4 18.5±1.3 16.7±2.2 14.0±0.9
可进行多次、高频治疗，达到最好的治疗效果
EAAL技术的临床-实验室操作流程 Manufacturing process of Immunecell-LC
外周血 20-100ml
回输 100ml/次，1-8次
收集诱导的 杀伤细胞 扩增及活化
培养及扩增14-35天
16
EAAL的作用机制研究
自体肿瘤细胞的体外杀伤效应（IFN-γ）