扩增活化的自体淋巴细胞技术
新型技术“T细胞活化技术”
T淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞（胚胎期则来源于卵黄囊和肝）。
在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。
成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。
T细胞的再循环有利于广泛接触进入体内的抗原物质，加强免疫应答，较长期保持免疫记忆。
T细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原和表面受体。
这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。
图1-1 T细胞表面受体T淋巴细胞是在胸腺中分化成熟的淋巴细胞，故称胸腺依赖性淋巴细胞（Thymus-dependent lymphocyte），简称T细胞。
T细胞是由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中数量最多，功能最复杂的一类细胞。
T细胞膜表面分子与T细胞的功能相关，也是T细胞的表面标志，可以用以分离、鉴定不同亚群的T细胞。
T细胞产生的免疫应答是细胞免疫，细胞免疫的效应形式主要有两种：与靶细胞特异性结合，破坏靶细胞膜，直接杀伤靶细胞；另一种是释放淋巴因子，最终使免疫效应扩大和增强。
图1-2 促进T细胞分化T细胞活化的标志应该是得到两个活化信号活化信号1是T细胞受体TCR与相应的抗原肽-MHC分子结合这里要注意，CD4+细胞是与抗原肽-MHC II类分子结合CD8+细胞与抗原肽-MHC I类分子结合CD4/CD8是TCR的辅助受体，也存在于T细胞表面结合后TCR-CD3复合体有了信号传导的能力CD3复合体的肽链胞浆区内含有ITAM（免疫受体酪氨酸活化基序），ITAM可以把活化的信号传导至细胞内部，至此得到活化信号1只有活化信号1还不可以使T细胞活化，这时需要活化信号2活化信号2就是由细胞表面的黏附分子来完成的对于T细胞来说，CD28是产生活化信号的共刺激分子，它与与此T细胞接触的APC(抗原呈递细胞）表面的B7分子结合后，即可产正活化信号此为第二活化信号需要说明的是，如果CD152与B7结合，产生的却是抑制信号，因为CD152胞内区含有ITIM（受体酪氨酸抑制基序）。
一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用[发明专利]
![一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/736d7e3691c69ec3d5bbfd0a79563c1ec4dad755.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710493447.0(22)申请日 2017.06.26(71)申请人 杭州中赢生物医疗科技有限公司地址 310052 浙江省杭州市滨江区楚天路88号(72)发明人 王冶陶 吴忠福 彭昉 刘慧显 王俊俊 俞英豪 (74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司11332代理人 巩克栋(51)Int.Cl.C12N 5/0783(2010.01)C12N 5/10(2006.01)A61K 35/17(2015.01)A61P 35/00(2006.01)A61P 35/02(2006.01)A61P 31/04(2006.01)A61P 31/12(2006.01)A61P 31/10(2006.01)A61P 33/00(2006.01)A61P 1/16(2006.01)A61P 31/20(2006.01)A61P 31/18(2006.01)A61P 31/14(2006.01)(54)发明名称一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用(57)摘要本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体涉及一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用。
所述培养体系包括：白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的混合物。
采用本发明培养体系扩增的NK细胞，NK细胞纯度高，对肿瘤细胞杀伤力强，在第14天可以将NK细胞扩增约9100倍，达到各种临床适合治疗病症预期疗效应用要求；解决了临床应用培养体系的安全性问题，有效降低NK细胞的应用成本，为NK细胞过继免疫治疗的广谱应用奠定了基础。
权利要求书2页 说明书6页 附图2页CN 107177548 A 2017.09.19C N 107177548A1.一种体外扩增淋巴细胞的培养体系，其特征在于，所述培养体系包括：白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的混合物。
EAAL
EAAL扩增活化的自体淋巴细胞治疗肿瘤技术简介Introduction of EAAL Therapy 肿瘤免疫治疗的机制Mechanisms of Cancer Immunotherapy通过调动机体自身的免疫系统，达到控制肿瘤生长，杀伤肿瘤细胞的目的。
? 前提：–肿瘤细胞有别于正常细胞? 肿瘤抗原? 肿瘤特异性T细胞免疫应答? 肿瘤特异性抗体免疫应答? 天然免疫对肿瘤细胞的杀伤作用如何达到有效的免疫治疗效果? 有足够可以识别肿瘤抗原的杀伤性T细胞? 机体的免疫环境有利于上述细胞发挥抗肿瘤功能–Th1/Th2 – Treg ? 这些T细胞可以到达肿瘤组织局部– T 细胞归巢? 在肿瘤局部，这些T细胞可以发挥有效的杀伤功能–肿瘤基质及肿瘤组织微环境肿瘤的免疫治疗方法Approches of Cancer Immunotherapy 肿瘤疫苗过继细胞免疫治疗细胞免疫治疗Cellular Immunotherapy ? ? 包括肿瘤在内的多种慢性病的最重要的生物治疗方法之一肿瘤的细胞免疫治疗：–非特异性※LAK细胞※CIK细胞※EAAL细胞–特异性※Provenge,树突状细胞※肿瘤特异性T细胞其它慢性病的细胞免疫治疗：※慢性病毒感染性疾病乙肝、丙肝艾滋病※慢性寄生虫感染※糖尿病※多发性硬化症※系统性红斑狼疮扩增活化的自体淋巴细胞（EAAL）的定义自体免疫细胞治疗技术CD3+ T淋巴细胞为主（95.91%±0.24% ），含少量NK细胞体外扩增活化肿瘤杀伤功能改进的LAK和CIK治疗：细胞培养效率和肿瘤杀伤能力显著增强EAAL是Expanded Activated Autologous Lymphocytes（扩增活化的自体淋巴细胞）的简称。
其定义是通过采取机体自身20-100ml静脉血，分离获得0.8-3 x 107外周血单个核细胞，经过体外无血清培养基培养，获得以CD3细胞为主的，包含CD8+ T淋巴细胞、CD4+ T淋巴细胞、CD3+CD56+ NKT细胞、NK细胞，细胞数量在3 x 109以上的活化的混合淋巴细胞，这些细胞在体外具有明确肿瘤杀伤功能。
过继免疫细胞治疗基础篇-6细胞产品
SOCS1 SOCS1
IRAK TRAF6 I B p50 RelA
IKK IKK IKK
节作用，限制抗原呈递的时间和强度，
从而限制自体抗肿瘤免疫反应。 该研究第一次提出了抑制免疫负调控 因子来增强DC疫苗的概念
Nature Biotechnol. 2004; 22:1521-2
四、AIL细胞
扩增活化的自体淋巴细胞（Autologou s Immunotherapy Lymphocytes,AI L），又称为高效CIK细胞。 是从患 者自体外周血（50-100ml）中分离单 个核细胞，经过体外激活扩增培养，得
到的一种在生理条件下能够杀伤肿瘤细
胞的细胞群，主要效应细胞包括MHC限 制性效应细胞（CD3+CD8+细胞毒性T 细胞、CD3+CD4+辅助性T细胞）、非
肿瘤相关抗原 (tumor-associated antigen , TAA)
• intracellular Survivin (T cells) • surface MUC1 (T cells and Ab)
分泌型FliC: TLR5 ligand
• auto- and paracrine activation of APCs (enhanced Signals 2/3)
iAPA-细胞
七、CTL细胞
CTL(Cytotoxic T Lymp
hocyte)，细胞毒性T细胞，
其表面标志是CD8。这些细胞 的功能就像一个“杀手”，它
们可以直接攻击带有特殊抗原
的靶细胞，在抗病毒感染和抗 肿瘤免疫中具有极其重要的用，
细胞毒性T细胞也被称为杀手
细胞免疫疗法
机体内具有杀伤作用的淋巴细胞有自然杀伤细胞、杀伤细胞杀伤性T细胞等，它们本身就能够对抗肿瘤细胞的产生。
根据实验观察，一个肿瘤细胞需要上百个淋巴细胞对付它。
而一立方厘米大小的瘤块中约有10亿个瘤细胞。
因此，如果有大量的淋巴细胞，就能够有效的消灭肿瘤细胞，对抗肿瘤细胞的生成，这就是细胞免疫疗法的基本理念。
[1]简介机体内具有杀伤作用的淋巴细胞有自然杀伤细胞、杀伤细胞杀伤性T细胞等，它们本身就能够对抗肿瘤细胞的产生。
根据实验观察，一个肿瘤细胞需要上百个淋巴细胞对付它。
而一立方厘米大小的瘤块中约有10亿个瘤细胞。
因此，如果有大量的淋巴细胞，就能够有效的消灭肿瘤细胞，对抗肿瘤细胞的生成，这就是细胞免疫疗法的基本理念。
当前，以细胞免疫疗法为首的细胞生物治疗己经初露锋芒，成为肿瘤生物治疗中重要的发展方向。
细胞免疫疗法，其全称为过继性免疫细胞疗法，(adoptive cellular immunotherapy, ACI或AIT)，是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞(特异性和非特异性的)，直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞。
临床上是指将体外激活的自体或异体免疫效应细胞输注给患者，以杀伤患者体内的肿瘤细胞的一种治疗方式。
近年来，细胞免疫疗法一直是肿瘤生物治疗中最活跃的领域。
细胞免疫疗法对细胞免疫功能低下的患者，如大剂量化疗、放疗后、骨髓移植后、病毒感染损伤免疫细胞数量及功能的患者，尤其是血液/免疫系统肿瘤的患者更为适合。
发展细胞免疫治疗可选择性地抑制/杀伤肿瘤细胞,而且不依赖于荷瘤者的免疫功能,并可与放、化疗合用,自上世纪80年代以来已进行了大量研究。
该疗法历经LAK、TIL、CD3AK、CIK、DC-CIK、EAAL等发展阶段，其疗效、特异性、整体有效率、副作用反应等方面的情况逐步改善。
分类LAK细胞免疫治疗LAK细胞即淋巴因子激活的杀伤细胞。
将外周血淋巴细胞在体外经淋巴因子白介素-2(IL-2)激活3～5天而扩增为具有广谱抗瘤作用的杀伤细胞。
自体免疫细胞(T细胞、NK)治疗技术管理规范
自体免疫细胞（T细胞、NK细胞）治疗技术管理规范国家卫生部医政处第三类技术准入制管理免疫细胞治疗技术是使用体外培养获得免疫活性细胞作为治疗手段的医疗技术。
本管理规范适用于在临床上已完成安全性和有效性认证，并符合伦理要求，只涉及T细胞和NK细胞作为治疗手段的医疗技术。
这类新技术已在世界多个国家开展，目前基本处于临床试验阶段。
为规范细胞免疫治疗技术临床应用，保证医疗质量，保障人体健康，保障公民的合法权益，并促进我国相关生物治疗技术的发展，特制定本规范。
第一部分自体免疫细胞治疗技术的范畴自体免疫细胞治疗技术：从自体外周血中分离的单个核细胞经过体外激活和扩增后输入患者体内，直接杀伤肿瘤细胞或病毒感染细胞，或调节和增强机体的免疫功能。
这类细胞免疫治疗技术主要包括：一. 自体CIK细胞（自体细胞因子诱导的杀伤细胞）二. 自体TIL细胞（自体肿瘤浸润淋巴细胞）三. 自体DC-CIK细胞（自体树突状细胞刺激的CIK细胞）四. 自体CTL细胞（细胞毒T淋巴细胞）五. 自体γδT细胞（自体伽马德尔塔T细胞）六. 自体NK细胞（自然杀伤细胞）第二部分自体免疫细胞治疗技术临床应用机构要求一、临床应用机构基本要求（一）开展自体免疫细胞治疗技术应当与该医疗机构功能、任务相适应。
（二）具有卫生部门核准登记的三级甲等医院或省级及省级以上专科医院。
（三）具有与免疫细胞治疗相关的科室。
科室人员组成包括有从事人体免疫细胞治疗相适应的执业医师、执业护士、具有免疫学专业背景的专家和免疫细胞制备技术人员。
该科室职责包括接受体细胞免疫治疗患者的选择，治疗方案的制定，患者的管理和随访，疗效评估体系的建立，规范治疗的程序建立，以及在治疗过程中处理可能出现的问题等。
具备从事体细胞治疗质量控制的专业检验科室和人员。
（四）具有人体免疫细胞治疗所需要的场地、设备和设施。
（五）医院设有管理规范、运作正常的临床伦理委员会，该委员会中从事人体细胞免疫治疗的相关人员不超过委员人数的1/4。
EAAL与EGF
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使用14天后
使用前
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使用9天后
使用前
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rhEGF修复案例
EGF与创伤修复 提高愈合的速度和质量
创造了医学史上的奇迹
被誉为“创伤修复的奇葩”
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一组珍贵的“小屁股”照 片
周某，4岁，洗浴 时烫伤，广州红会 医院诊断为深II度
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第1天
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第3天
第7天
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第14天
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一个月后
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康复后的周 某与其父亲
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2 技术连通性分析
预防、治疗肿瘤
提高免疫力 剔除衰老细胞
逆分化、抗衰老
健康美丽
病理性皮肤 亚健康皮肤
EAAL+rhEGF
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2 技术连通性分析
可靠的 基地及 产品
分子细胞 水平改善
保健抗衰
采用前沿 的新生物 技术
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2 技术连通性分析
EAAL与rhEGF分析表
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3 技术产业化背景分析 EAAL技术方
rhEGF从外表皮肤细胞抵抗衰老：
人体的新陈代谢及细胞的更新能力随着年龄的 增长逐渐衰退，rhEGF的含量也在不断减少。 肌肤细胞的衰老速度大于新生速度，不可避免 地呈现出衰老状态，导致肤质粗糙、灰黯、缺 水，并且出现皱纹、色斑等。 通过外界补充同源的rhEGF，激活皮肤细胞的 生理活性，促进皮肤细胞的分裂再生；使其逆 分化为表皮干细胞，皮肤中新生细胞数目增多， 新陈代谢能力回复正常；老化细胞不断减少， 细胞的整体平均年龄降低，肌肤呈现出健康年 轻的状态，实现晶莹透亮、富有弹性的好肤质。
1 技术原理分析
EAAL
EAAL一、EAAL的定义EAAL，是扩增活化的自体淋巴细胞的英文Expanding Activated Autologous Lymphocytes的缩写，EAAL细胞技术是治疗肿瘤和慢性传染性病毒感染的细胞免疫治疗方法之一。
其技术是从患者自体外周血（20-100毫升）中分离单个核细胞，经过体外刺激扩增培养，使在生理条件下具有杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的杀伤性效应的细胞亚群，主要是CD8+杀伤性T淋巴细胞（CTL，约70%）和自然杀伤细胞（NK，约20%）得到大量扩增和活化，之后经一次或多次回输给患者。
作为细胞过继性免疫治疗方法，可有效辅助恶性肿瘤和慢性传染性病毒感染的治疗。
二、EAAL治疗肿瘤的作用机制根据体外实验和临床试验证明，EAAL细胞可通过多种途径直接杀伤肿瘤细胞：1) 患者回输EAAL细胞后可以导致CD8+杀伤性T淋巴细胞比例上升，NK细胞比上升，CD4/CD8 T淋巴细胞比值下降。
这些杀伤性淋巴细胞以不同的机制识别肿瘤细胞，通过穿孔素等作用，穿透封闭的肿瘤细胞胞膜，实现对肿瘤细胞的裂解；2) 回输EAAL细胞后，可促使机体分泌IL-2、IL-6、IFN-γ等多种抗肿瘤的细胞因子，诱导肿瘤细胞凋亡；3) 回输EAAL细胞后可以改善机体的免疫环境，提高机体的免疫机能。
一、EAAL的定义EAAL，是扩增活化的自体淋巴细胞的英文Expanding Activated Autologous Lymphocytes的缩写，EAAL细胞技术是治疗肿瘤和慢性传染性病毒感染的细胞免疫治疗方法之一。
其技术是从患者自体外周血（20-100毫升）中分离单个核细胞，经过体外刺激扩增培养，使在生理条件下具有杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的杀伤性效应的细胞亚群，主要是CD8+杀伤性T淋巴细胞（CTL，约70%）和自然杀伤细胞（NK，约20%）得到大量扩增和活化，之后经一次或多次回输给患者。
作为细胞过继性免疫治疗方法，可有效辅助恶性肿瘤和慢性传染性病毒感染的治疗。
CIK-DC简介2014资料
2013年10月
内容提要
一、肿瘤生物治疗概述 二、CIK细胞治疗技术 三、DC细胞治疗技术 四、政策法规 五、卫生部第三类临床技术准入 六、公司技术优势简介
一、肿瘤生物治疗概述
1、肿瘤疗法分类
传统疗法： 手术治疗 放射治疗 化学治疗 新兴疗法： 生物治疗 其他疗法：射频、氩氦刀、热疗、介入等
二、CIK细胞治疗技术
（非特异性免疫细胞治疗技术）
5-A、非特异性细胞免疫治疗可以有效控制实体肿
瘤复发、延长患者无瘤生存期
2000年，Yamazaki T等人在柳叶刀（The Lancet）杂志报道了体 外扩增活化自体淋巴细胞预防肝癌术后复发的随机对照临床实 验研究。受试的150名患者分为两组，均接受了根治性肝癌切除 术，随后一组接受过继性免疫治疗（76例），一组不采用任何 辅助治疗（74例）。患者自体淋巴细胞在体外经重组人IL-2和 抗CD3抗体刺激培养扩增，并在术后的6个月内分五次回输患者。 经术后随访（随访时间为0.2-6.7年，中位数为4.4年），接受细 胞免疫治疗组与对照组比较，肿瘤复发率下降18%，复发风险 率下降41%。且肿瘤复发时间较对照组大延后。免疫治疗组3年 无复发率为48%（对照组为33%），5年无复发率为38%(对照 组为22%)。临床研究研究结果表明这种非特异性免疫治疗极大 延长了肝癌患者术后无复发生存时间。
五、卫生部第三类临床技术准入
卫办医政发〔2009〕84号
谢谢大家！
7、CIK细胞的临床应用医院
近10年来，先后已有301医院、302医院、天津肿瘤医院、北 京肿瘤医院、中山大学附属肿瘤医院、华西医科大学附一院、 309医院、辽宁省肿瘤医院等多家单位较规范性的开展了肿瘤CIK 细胞的研究和治疗工作，治疗病例数已过数千例。另外，302医 院应用CIK细胞治疗肝炎，病例数已约400例，取得了明显的效果 。
强效CIK生物免疫治疗
全球顶尖肿瘤治疗技术—第5代强效CIK，正悄然兴起1、强效CIK疗法适应症：●已明确诊断的恶性实体瘤：肝癌，肺癌，肾癌，黑色素瘤，乳腺癌，恶性脑肿瘤，卵巢癌，前列腺癌，膀胱癌，食道癌，胰腺癌，宫颈癌等；●慢性传染病或感染患者：乙型肝炎，丙型肝炎患者，慢性寄生虫感染等●体质虚弱或有肿瘤病史的人群2、强效CIK细胞治疗禁忌症◆T细胞淋巴瘤，骨髓瘤，部分外周侵犯的淋巴瘤◆器官移植后，长期使用免疫抑制药物或正在使用免疫抑制药物的患者◆自身免疫病患者3、副作用强效CIK细胞回输时，部分患者（10—15%）会出现低热（37—38℃），这是短时间的自限性症状，回输后0.5—4小时即可恢复正常，可不处理或者使用解热剂对症处理即可。
第5代强效CIK细胞治疗流程扩增活化的自体淋巴细胞（强效CIK）治疗肿瘤-------最好的医生就是自身“免疫系统”恶性肿瘤是威胁人类健康和生命的最大因素之一，自1982年国外学者提出生物反应调节剂以来，肿瘤的生物治疗越来越受到国内外学者的重视。
随着细胞生物学，分子生物学及生物工程技术的迅速发展，肿瘤的生物治疗研究取得了重大突破，越来越多的被用于恶性肿瘤患者的治疗，对于杀灭肿瘤细胞，促进患者免疫系统重建，消除残余病变以及骨髓净化，预防肿瘤的复发和转移都具有良好的效果。
人体的免疫系统存在的T淋巴细胞能够直接杀伤靶细胞，监控肿瘤细胞的增殖，是抵御病毒感染、肿瘤形成的英勇斗士。
但是，在肿瘤患者体内，免疫系统功能明显减弱，T淋巴细胞的数量和功能都有不同程度的下降，难以抵御肿瘤细胞的大规模增生。
因此，国内众多著名医院都采用了国际先进水平的强效CIK技术，通过从自身静脉血中提取淋巴细胞，在体外进行扩增，然后将活化的淋巴细胞回输患者体内，用自身免疫细胞杀伤肿瘤细胞，以此达到治疗肿瘤的目的。
使用该项技术进行肿瘤的治疗，因为全部细胞都是自体细胞，不会引起排异反应，也不会有大量使用化疗药物的各种副反应，效果安全且疗效确切，在临床实践中已经得到了证实。
EAAL细胞免疫疗法
EAAL细胞免疫疗法【定义】EAAL，是扩增活化的自体淋巴细胞的英文Expanding Activated Autologous Lymphocytes 的缩写，EAAL细胞技术是最新的治疗肿瘤和慢性传染性病毒感染的细胞免疫治疗方法之一。
其技术是从患者自体外周血（20-100毫升）中分离单个核细胞，经过体外刺激扩增培养，使在生理条件下具有杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的杀伤性效应的细胞亚群，主要是CD8+杀伤性T淋巴细胞（CTL，约70%）和自然杀伤细胞（NK，约20%）得到大量扩增和活化，之后经一次或多次回输给患者。
作为细胞过继性免疫治疗方法，可有效辅助恶性肿瘤和慢性传染性病毒感染的治疗。
【特点】使用无血清淋巴细胞培养基进行细胞培养，保证没有潜在的病源微生物感染；细胞扩增的高效性和高活性:扩增效率约为200~1000倍；不需使用单采机，对患者免疫系统没有破坏作用；独特的细胞培养工艺，少量外周血即可满足多次细胞回输的要求；可与化疗联合，完全满足多个化疗疗程对细胞治疗次数和细胞治疗数目的要求，从而产生较好的协同治疗肿瘤效果；可进行多次、高频治疗，达到最好的治疗效果。
【效应】CD8+ 杀伤性T淋巴细胞比例上升；NK细胞比例上升；CD4/CD8 T淋巴细胞比值下降；分泌的IFN-γ细胞比例上升；IFN-γ的分泌量上升。
【疗效】有效控制实体肿瘤复发和进展、延长患者无瘤生存期；有效杀灭实体肿瘤细胞及体内散在的肿瘤细胞，包括复发和转移的肿瘤；配合常规放化疗延长病人生存期，实现无瘤、带瘤生存；提高放化疗耐受性，形成综合治疗的协同性；显着提高病人生存质量。
【适应症】各类恶性肿瘤的主治手段，尤其是无法进行手术、放疗、化疗的中晚期患者；手术后患者的协同治疗，可防止肿瘤转移复发；放疗或化疗后患者的综合治疗；放疗、化疗失败的患者；骨髓移植后或化疗缓解后的白血病患者；癌性胸、腹腔积液患者。
【禁忌症】感染发热期的患者（肿瘤热除外）;进行器官移植的患者;有严重自身免疫病的患者;T细胞相关淋巴瘤和白血病患者。
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如何达到有效的免疫治疗效果
• 有足够可以识别肿瘤抗原的杀伤性T细胞 • 机体的免疫环境有利于上述细胞发挥抗肿瘤功能
– Th1/Th2 – Treg
• 这些T细胞可以到达肿瘤组织局部
– T 细胞归巢
• 在肿瘤局部，这些T细胞可以发挥有效的杀伤功能
– 肿瘤基质及肿瘤组织微环境
肿瘤的免疫治疗方法
Approches of Cancer Immunotherapy
G5
阳性对照组
腹腔
2 mg/kg
10 ml/kg
10 (4M41 – 4M50)
847.92
0.64
p < 0.05
G2 G1
G3
G5
G4
EAAL对患者体内免疫环境的改变作用
1. 2. 3. 4. 5. CD8+ 杀伤性T淋巴细胞比例上升 NK细胞比例上升 CD4/CD8 T淋巴细胞比值下降 分泌的IFN-γ细胞比例上升 IFN-γ的分泌量上升
肠切除术和局部淋巴结清扫。
5.27 8.37 0.59 0.24 0.41 1.06 4.44 4.19
1.13
12.24 10.83 0.2 0.25 1.25 0.6 11.76 19.60
0.78
8.7 11.15 0.22 0.31 1.41 0.66 10.01 15.17
EAAL在裸鼠体内 对HepG2形成肿瘤的抑制作用
EAAL 扩增活化的自体淋巴细胞 治疗肿瘤技术简介
Introduction of EAAL Therapy
肿瘤免疫治疗的机制
Mechanisms of Cancer Immunotherapy
• 通过调动机体自身的免疫系统，达到控制肿
瘤生长，杀伤肿瘤细胞的目的。
• 前提：
–肿瘤细胞有别于正常细胞 • 肿瘤抗原 • 肿瘤特异性T细胞免疫应答 • 肿瘤特异性抗体免疫应答 • 天然免疫对肿瘤细胞的杀伤作用
EAAL技术特点
使用无血清淋巴细胞培养基进行细胞培养，保证没有潜在的病源微生物感染 细胞扩增的高效性和高活性:扩增效率约为2001000倍
不需使用单采机，对患者免疫系统没有破坏作用
独特的细胞培养工艺，少量外周血即可满足多次细胞回输的要求
可与化疗联合，完全满足多个化疗疗程对细胞治疗次数和细
胞治疗数目的要求，从而产生较好的协同治疗肿瘤效果。
6.59 0.39 0.25 0.64 0.45 0.28 0.62 0.52 043 0.06 0.36 6.00 0.15 0.22 1.47
2.3
7.19 0.1 0.51 5.10 0.07 0.36 5.14 0.23 0.48 2.09
P=0.0060 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
PRE POST
65 60 55 50
CD3-IFN-g+
P=0.0145
Percentage
Percentage
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
PRE
POST
CD3+CD8+IFN-g+
P=0.0269
裸鼠注射EAAL细胞的剂量分组
注射渠道 组别 G1 G2 G3 G4 阴性对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 微静脉 微静脉 微静脉 微静脉 注射剂量 (细胞数/只) 0 1.7 × 105 5 × 105 15 × 105 注射液量 (ml) 0.3 0.3 0.3 0.3 每组裸鼠数量 (个体号) 10 (1M01 – 1M10) 10 (2M11 – 2M20) 10 (3M21 – 3M30) 10 (4M31 – 4M40) 每组肿瘤 平均体积（mm3 ） 1444.69 1236.45 979.91 941.39 每组肿瘤 平均重量（g ） 0.96 0.82 0.73 0.72
Percentage
Percentage
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
PRE
POST
PRE
POST
IFN-g+
***P=0.0005
100
75
Percentage
50
25
0
PRE
POST
The subsets of IFN-gamma+ lymphocytes
CD3+IFN-γ +
(注：联合作用组、单顺铂组和单淋巴细胞作用组抑制率进行单因素方差分析,P<0.01 *)
EAL细胞的肿瘤抗原特异性分析
Donor A2-01 Cancer Antigen BC(%) 0.17 0.86 0.32 A2-02 A2-03
NY-ESO-1
AC(%)
Multiple BC(%)
1.12
83.7 10.6 63.0 0.2 11.7 11.8 1.7
EAAL细胞分泌Th1类细胞因子
A
IL-2 PHA
0
1
5 (mg/ml)
B
IFN-g
1800 1500
untreated 1 mg/ml PHA 5 mg/ml PHA
IL-4
Ratios tob-actin
1200 900 600 300 0
0.01 0.005
（LANCET 2000;356;802-07）
一例晚期肝癌患者实现6年带瘤生存 Hepatology (28),5,1436-7,1998.
• 患者：
– 62岁，男性，丙肝，肝癌Child B级，约7厘米大小。已出现右门静脉肿瘤栓塞和右肾转移（ T4N0M1,ⅣB期）该肿瘤已无法切除。该患者因此接受了质子照射治疗，治疗后肿瘤出现坏死 并且体积缩小至原来的50%。
扩增活化的自体淋巴细胞（EAAL）的定义
• • • •
自体免疫细胞治疗技术 CD3+ T淋巴细胞为主（95.91%±0.24% ），含少量NK细胞 体外扩增活化 肿瘤杀伤功能
• 改进的LAK和CIK治疗：细胞培养效率和肿瘤杀伤能力显著增强
• EAAL是Expanded Activated Autologous Lymphocytes（扩增活化的自体 淋巴细胞）的简称。其定义是通过采取机体自身20-100ml静脉血，分离 获得0.8-3 x 107外周血单个核细胞，经过体外无血清培养基培养，获得 以CD3细胞为主的，包含CD8+ T淋巴细胞、CD4+ T淋巴细胞、CD3+CD56+ NKT细胞、NK细胞， 细胞数量在3 x 109以上的活化的混合淋巴细胞，这 些细胞在体外具有明确肿瘤杀伤功能。
•
结果：
– 获得了6年无复发生存，整个过程没有出现治疗相关的不良反应。在长期观察中，该患者健康 状况良好，未出现肝癌的复发，且肝功能好转。
左眼睑细胞鳞癌和结肠腺癌双原发
（Jpn J Clin Oncol 2000:30(6)267-271 ）
• 患者：
– 同时患有左眼睑细胞鳞癌和结肠腺癌，两者都已出现淋巴结转移。患 者接受了左眼剜除术及左颈部改良根治性淋巴结清扫术和随后的跨结
25
50
CD3+CD8-IFN-g+
P=0.0079
20
40
Percentage
Percentage
15
30
10
20
5
10
0
0
PRE
POST
PRE
POST
The change of the ratio of IFN-gamma+ cells
EAAL的疗效
• 单独使用
–手术后预防复发 –稳定肿瘤 –改善生活质量
可进行多次、高频治疗，达到最好的治疗效果
EAAL技术的临床-实验室操作流程 Manufacturing process of Immunecell-LC
外周血 20-100ml
回输 100ml/次，1-8次
收集诱导的 杀伤细胞 扩增及活化
培养及扩增14-35天
16
EAAL的作用机制研究
自体肿瘤细胞的体外杀伤效应（IFN-γ）
CD3+CD8+
P=0.0036
50
40
Percentage
30
20
10
0
PRE
POST
CD3-CD56+
50
P=0.0485
PRE
40
Percentage
30
POST
20
10
0
PRE
POST
CD4/CD8
P=0.0333
7 6 5 4 3 2 1 0
CD3+CD4+
65 60 55 50
P=0.5278
•
EAAL治疗：
– – – – – – 放射治疗之后 患者每1－2月应用一次过继性免疫治疗 平均每次回输细胞1.4±0.5×10（10） 绝大多数为T细胞标记阳性（95%±2% CD3+，90％±2%CD3+/HLA-DR+，61%±9% CD8+ ，39%±8% CD4+）且对Daudi细胞具有细胞毒活性的细胞。 细胞回输在6年内共为53次完成（平均5-6周一次回输） 累计回输细胞总数为7.3×10（11）
经EAAL治疗后，患者体内杀伤性淋巴细胞数量和比 例显著增加
EAAL为CD8+ T细胞为主
细胞表面分子 培养前的百分比 （均值）
CD3 CD4 CD8 CD4/CD8 CD3+CD56+ CD3-CD16+ CD4+CD25+ 65.0 33.2 22.8 1.9 5.4 12.6 3.3