单向辐射状免疫扩散试验SRIDMancini技术
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抗体
定义:抗体又称免疫球蛋白(Ig),是对抗原(引起抗体产生的外
来大分子物质)反应而产生的蛋白质。
抗体是免疫系统的重要组成部分,保护动物免遭某些疾
病的侵害。人的Ig有5种类型,分别以IgG，IgA，IgM， IgD，IgE表示，其中分别以IgG是脊椎动物体内主要的
抗体。
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1.制备含有一定量抗体的琼脂糖凝胶,铺在水平放置的玻璃表面或平板上。
2.在凝胶上钻几个固定直径的圆孔。
3.向每一个孔中加入已知量的抗原或实验溶液。
4.室温下,在潮湿的培养箱中水平防止,抗原在凝胶中扩散,形成沉淀。
5.在黑色背景下(侧面照明)检查平板,也可使用蛋白质染料染色后观察。
6.检测沉淀环的直径。
免疫技术
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绪论
早在一千多年前人们就已经通过临床观察,摸索出了预防某些 瘟疫的方法, 也就是免疫技术的最早形式。近几十年免疫学的研究 范围已扩大到生物学的许多方面及临床医学的各个领域，免疫学的 研究从宏观走向微观，从细胞水平过渡到分子水平,并且在多方面取 得了突破性进展,进入了分子免疫学时代。如今免疫学又有许多重大 发展和发现,分支更加多样,产生了基础免疫学﹑临床免疫学和免疫 技术三个独立的学科。今天我们就着重学习一下免疫技术。
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抗原和抗血清之间的各种反应有(如图):
●相同: ●不相同: ●部分相同:
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多克隆抗体
概念:
用带有多种抗原决定簇的抗原性物质免疫动物所得到的抗体。 通常用来免疫动物的抗原性物质，大多是由多种抗原分子组成的， 有时即便是一种抗原分子，也是由多种抗原决定簇组成。这种抗原 可刺激具相应抗原受体的不同淋巴细胞克隆，因此产生的抗血清是 多种抗体，即多克隆抗体的混合物。在实验动物体内反复注射抗原 可以产生多克隆抗体。
待测抗原 竞争力强, 放射性标 记配体结 合量少。
这种技术使用放射性标记的抗
抗原或半抗原的Log10对数
体(而不是抗原)来直接测定样品中 放射免疫测定标准曲线示意图
抗原伙伴抗原的量。
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酶免疫测定(ELA)技术
该技术也称为酶联免疫吸附试验(ELISA) 。通过把抗体或抗原 与某种酶的一个位点相结合(结合后不能影响两者的活性),将抗原— 抗体互作的特异性与酶分析的敏感性结合起来。加入一种合适的产 色底物,进行酶量测定(见下2页图)。其中主要的技术有:
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放射免疫技术
放射免疫测定法:
这种方法是以放射性标记的抗 原(或半抗原)和未标记的抗原之间 竞争有限数量抗体上的结合位点为
工作区域
基础的。待测溶液中抗原的量可通 放 待测抗原
过已知量的放射性标记的抗原和固 定量的抗体进行测定(如右图) 。
射 活 性
竞争力弱, 放射性标
免疫放射分析:
记配体结 合量多。
7.用含有已知量的抗原的样品绘制标准曲线:沉淀环直径的平方直接与孔中 抗原的量成正比。
8.根据标准曲线计算待侧溶液中的抗原含量。
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双向免疫扩散技术(Ouchterlony技术)
该技术广泛应用于检测待侧溶液中特定的抗原或寻找不同 抗原之间的交叉反应。
方法与过程: 1.在水平放置的玻璃板上制备琼脂糖凝胶。 2.在凝胶上钻几个圆形的加样孔。 3.在相邻的孔中分别加入含有抗原和多克隆抗血清的待测溶液。 两种溶液都向外扩散,在抗原和相应的抗体以最适比率存在的 地方,形成肉眼可见的沉淀线。
1.交换电泳(对流电泳)
该技术中,抗原和抗体分别置于不 同的孔中,它们的相向移动是由电 势差推动的:大多数抗原向阳极迁 移,而IgG向阴极迁移。该法比双向 免疫扩散法灵敏度高,15-20分钟即 可完毕。
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2.定量免疫电泳(劳氏火箭免疫电泳)
抗体加到琼脂糖平板中,而抗原放在 孔中。利用电压驱使抗原进入凝胶, 通常移入正极,而抗体则移向阴极。 达到平衡状态后,形成一个具有尖峰 的火箭型沉淀线。平衡时每一“火 箭”的高度与加到孔中的抗原量成 正比。绘制含有已知量抗原的样品 的标准曲线,可用来测定待测样品中 的抗原含量(见右图) 。
铰链区 （hinge region)）
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2﹑专一性 3﹑弹性 4﹑可标记性
二﹑功能 (见右图)
1、与抗原特异性结合
2、激活补体C1q
3、亲细胞性 4、通过胎盘
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抗体的产生
1﹑多克隆抗体 2﹑单克隆抗体
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凝集反应
定义:当抗体与颗粒状抗原悬浮 液(如细胞或胶粒)相互作用时, 形成的免疫复合物(见图)产生肉 眼可见的团块,称为凝集反应。
用途:
●微生物鉴定
●乳胶凝集反应(结合抗原)
●乳胶凝集反应(结合抗体)
●血细胞凝集反应
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免疫扩散测定法
1﹑单向辐射状免疫扩散试验(SRID,Mancini技术) 2﹑双向免疫扩散技术(Ouchterlony技术)
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免疫电泳测定法
免疫电泳测定法将沉淀反应 与电泳迁移作用结合起来,是一种 清晰度好﹑分辨率高﹑更灵敏﹑更 快速的检测方法(如图)。主要的技 术有:
间接酶联免疫吸附试验(indirect ELISA): 该方法用于检测抗体。将
特异性抗原与固体支持物 相连,加入合适的抗体,使之 与抗原结合,漂洗时不被冲 走。结合的抗体用酶联抗 免疫球蛋白进行检测。
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单向辐射状免疫扩散试验(SRID,Mancini技术)
该技术用于检测用液中的抗原数量,方法如下(见下页图):
IgG的特性和功能
一﹑特性
1﹑形状与结构:“Y”形分子,具有两个抗原结合部位。
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免疫球蛋白的结构区和功能区:
轻链 Fra Baidu biblioteklight chain,L)
重链 （heavy chain,H）
可变区 (variable region,V)
恒定区 （constant region,C）
功能区 L链可变区（VL） L链恒定区（CL）
双抗体夹层酶联免疫吸附试验(double antibody sandwich ELISA)
该方法用于检测特异性抗原,涉及到一个三组分复合物,包括与固体
支持物相连的捕获抗体、与捕获抗体结合的抗原和与抗原结合的酶
联第二抗体。该方法可以用来检测特殊的抗原或对抗原进行定量分
析。
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抗体
定义:抗体又称免疫球蛋白(Ig),是对抗原(引起抗体产生的外
来大分子物质)反应而产生的蛋白质。
抗体是免疫系统的重要组成部分,保护动物免遭某些疾
病的侵害。人的Ig有5种类型,分别以IgG，IgA，IgM， IgD，IgE表示，其中分别以IgG是脊椎动物体内主要的
抗体。
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1.制备含有一定量抗体的琼脂糖凝胶,铺在水平放置的玻璃表面或平板上。
2.在凝胶上钻几个固定直径的圆孔。
3.向每一个孔中加入已知量的抗原或实验溶液。
4.室温下,在潮湿的培养箱中水平防止,抗原在凝胶中扩散,形成沉淀。
5.在黑色背景下(侧面照明)检查平板,也可使用蛋白质染料染色后观察。
6.检测沉淀环的直径。
免疫技术
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绪论
早在一千多年前人们就已经通过临床观察,摸索出了预防某些 瘟疫的方法, 也就是免疫技术的最早形式。近几十年免疫学的研究 范围已扩大到生物学的许多方面及临床医学的各个领域，免疫学的 研究从宏观走向微观，从细胞水平过渡到分子水平,并且在多方面取 得了突破性进展,进入了分子免疫学时代。如今免疫学又有许多重大 发展和发现,分支更加多样,产生了基础免疫学﹑临床免疫学和免疫 技术三个独立的学科。今天我们就着重学习一下免疫技术。
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抗原和抗血清之间的各种反应有(如图):
●相同: ●不相同: ●部分相同:
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多克隆抗体
概念:
用带有多种抗原决定簇的抗原性物质免疫动物所得到的抗体。 通常用来免疫动物的抗原性物质，大多是由多种抗原分子组成的， 有时即便是一种抗原分子，也是由多种抗原决定簇组成。这种抗原 可刺激具相应抗原受体的不同淋巴细胞克隆，因此产生的抗血清是 多种抗体，即多克隆抗体的混合物。在实验动物体内反复注射抗原 可以产生多克隆抗体。
待测抗原 竞争力强, 放射性标 记配体结 合量少。
这种技术使用放射性标记的抗
抗原或半抗原的Log10对数
体(而不是抗原)来直接测定样品中 放射免疫测定标准曲线示意图
抗原伙伴抗原的量。
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酶免疫测定(ELA)技术
该技术也称为酶联免疫吸附试验(ELISA) 。通过把抗体或抗原 与某种酶的一个位点相结合(结合后不能影响两者的活性),将抗原— 抗体互作的特异性与酶分析的敏感性结合起来。加入一种合适的产 色底物,进行酶量测定(见下2页图)。其中主要的技术有:
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放射免疫技术
放射免疫测定法:
这种方法是以放射性标记的抗 原(或半抗原)和未标记的抗原之间 竞争有限数量抗体上的结合位点为
工作区域
基础的。待测溶液中抗原的量可通 放 待测抗原
过已知量的放射性标记的抗原和固 定量的抗体进行测定(如右图) 。
射 活 性
竞争力弱, 放射性标
免疫放射分析:
记配体结 合量多。
7.用含有已知量的抗原的样品绘制标准曲线:沉淀环直径的平方直接与孔中 抗原的量成正比。
8.根据标准曲线计算待侧溶液中的抗原含量。
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双向免疫扩散技术(Ouchterlony技术)
该技术广泛应用于检测待侧溶液中特定的抗原或寻找不同 抗原之间的交叉反应。
方法与过程: 1.在水平放置的玻璃板上制备琼脂糖凝胶。 2.在凝胶上钻几个圆形的加样孔。 3.在相邻的孔中分别加入含有抗原和多克隆抗血清的待测溶液。 两种溶液都向外扩散,在抗原和相应的抗体以最适比率存在的 地方,形成肉眼可见的沉淀线。
1.交换电泳(对流电泳)
该技术中,抗原和抗体分别置于不 同的孔中,它们的相向移动是由电 势差推动的:大多数抗原向阳极迁 移,而IgG向阴极迁移。该法比双向 免疫扩散法灵敏度高,15-20分钟即 可完毕。
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2.定量免疫电泳(劳氏火箭免疫电泳)
抗体加到琼脂糖平板中,而抗原放在 孔中。利用电压驱使抗原进入凝胶, 通常移入正极,而抗体则移向阴极。 达到平衡状态后,形成一个具有尖峰 的火箭型沉淀线。平衡时每一“火 箭”的高度与加到孔中的抗原量成 正比。绘制含有已知量抗原的样品 的标准曲线,可用来测定待测样品中 的抗原含量(见右图) 。
铰链区 （hinge region)）
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2﹑专一性 3﹑弹性 4﹑可标记性
二﹑功能 (见右图)
1、与抗原特异性结合
2、激活补体C1q
3、亲细胞性 4、通过胎盘
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抗体的产生
1﹑多克隆抗体 2﹑单克隆抗体
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凝集反应
定义:当抗体与颗粒状抗原悬浮 液(如细胞或胶粒)相互作用时, 形成的免疫复合物(见图)产生肉 眼可见的团块,称为凝集反应。
用途:
●微生物鉴定
●乳胶凝集反应(结合抗原)
●乳胶凝集反应(结合抗体)
●血细胞凝集反应
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免疫扩散测定法
1﹑单向辐射状免疫扩散试验(SRID,Mancini技术) 2﹑双向免疫扩散技术(Ouchterlony技术)
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免疫电泳测定法
免疫电泳测定法将沉淀反应 与电泳迁移作用结合起来,是一种 清晰度好﹑分辨率高﹑更灵敏﹑更 快速的检测方法(如图)。主要的技 术有:
间接酶联免疫吸附试验(indirect ELISA): 该方法用于检测抗体。将
特异性抗原与固体支持物 相连,加入合适的抗体,使之 与抗原结合,漂洗时不被冲 走。结合的抗体用酶联抗 免疫球蛋白进行检测。
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单向辐射状免疫扩散试验(SRID,Mancini技术)
该技术用于检测用液中的抗原数量,方法如下(见下页图):
IgG的特性和功能
一﹑特性
1﹑形状与结构:“Y”形分子,具有两个抗原结合部位。
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免疫球蛋白的结构区和功能区:
轻链 Fra Baidu biblioteklight chain,L)
重链 （heavy chain,H）
可变区 (variable region,V)
恒定区 （constant region,C）
功能区 L链可变区（VL） L链恒定区（CL）
双抗体夹层酶联免疫吸附试验(double antibody sandwich ELISA)
该方法用于检测特异性抗原,涉及到一个三组分复合物,包括与固体
支持物相连的捕获抗体、与捕获抗体结合的抗原和与抗原结合的酶
联第二抗体。该方法可以用来检测特殊的抗原或对抗原进行定量分
析。
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