小鼠单抗腹水纯化步骤

小鼠单抗腹水纯化

一、初纯——辛酸—硫酸铵法

【原理】

在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。

【溶液配制】

1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml

取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.

0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。

○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）

2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml

取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.

0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）

0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）

3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml

称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.

【步骤】

1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。

2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。

3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。

4、12000r/min，4℃，30min，收集上清。

5、上清液经普通滤纸过滤1次，加入1/10体积的10*PBS（0.1M pH7.4）用1M NaOH 调至7.4，冰浴至4℃。

6、根据每ml上述混合液加0.277g固体硫酸铵（0℃条件下，45%饱和硫酸铵为0.291g/ml），冰浴条件下边搅拌边缓慢加入硫酸铵，不可一次全部加入，而以小分量分多次慢慢溶入，并不时搅拌，以免造成局部浓度过高。缓慢加入时为了避免局部的浓度一下子很高，因为硫酸铵不同的浓度是沉淀不同的蛋白为主，这样就可能将不想沉淀的蛋白沉淀下来。冰浴条件是为了保证蛋白的活性，因为硫酸铵加入到辛酸溶液后会产热。

7、硫酸铵全加入后，再搅拌10-30min，使溶液完全平衡，然后就可以进行离心。一般采取4℃搅拌30min后，继续静置至少60min（一般过夜）。再13000r/min，4℃离心30min，弃上清，在短暂离心，将沉淀溶解于少量PBS中。但如果进行下面的亲和层析，可直接将沉淀溶解于1.5ml结合缓冲液中。

二、亲和层析

【HiTrap Protein AG HP 1ml（Amersham Bioscience）特性】

柱床体积：1ml

柱子大小：0.7*2.5cm

耐受压：0.3mPa

最大流速：4ml/min

建议流速：1ml/min

【protein G】

G组链球菌的表面蛋白，属于III型Fc受体，能以非免疫机制的方式结合IgG Fc区域。protein G和IgG在pH7.0时有很强的结合能力，而其结合产物的洗脱一般在pH2.5-3是进行。由于IgG对段敏感，会破坏其生物学活性，故一般在收集管种种加入60-200μl的1M Tris-HCl （pH9.0），一般用100μl/ml洗脱液，这样纯化的IgG最终会中和成中性。注意：经pH洗脱后在收集管内欲置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。

小鼠IgG单克隆抗体溶液在280nm时。1.44（吸光单位）相当于1mg/ml。

【缓冲液准备】

1、结合缓冲液：20mM sodium phosphate。pH7.0 定容至1000ml

称取7.6024g Na3PO4·2H2O（MW380.12），定容置1000ml，调pH至7.0.

2、洗脱缓冲液：0.1M Glycine-HCl，pH2.7 1000ml

称取7.507g Glycine（MW75.07），定容至1000ml，调pH至2.7.

【样品准备】

样品最好用结合缓冲液稀释，上柱前样品过滤（0.22μm滤膜）或离心。

【操作步骤】

1、在收集管中加入100μl的1MTris-HCl（pH9.0），用于收集1ml的洗脱液。

2、将注射器或泵管充满结合缓冲液。移去柱子上接口的塞子，用适配的接头子将其连接到注射器或者泵管，一“滴对滴“的方式充满柱子后方可以连接，避免空气进入主子。

3、移去柱子下接口的塞子，扭断即可。

4、用10ml（10个柱床体积）结合缓冲液洗柱子，流速为1ml/min

5、上样：用2ml上样环上样。

6、用5-10ml（5-10个柱床体积）结合缓冲液冲洗柱子，直到流出液中没有杂物质。

7、用2-5ml（5-10个柱床体积）洗脱液进行洗脱。

8、纯化产物可以利用Hi Trap Desalting 或PD-10柱交换缓冲液。

9、纯化结束后，用20%乙醇保存柱子，防止微生物的生长。