第1讲+工具酶
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分子间的连接：不同的DNA片断间的连接。 分子内的连接：同一片断的两个互补末端之间配对 而形成的环形分子。
⑴分子间ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ接
⑵分子内连接
3、限制酶的特性
a.限制酶识别的靶序列同DNA的来源无关； b.限制酶识别的靶序列是唯一的（对某种限制酶只具 一个限制位点的质粒） c.-20℃低温下保存 商品化的限制酶多采用50%的甘油缓冲液储存， 避免反复冻融
C
CTAG
G
杂种位点（hybrid site）
由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。 特点：一般不能被原来的任何一种同尾酶识别
BamHⅠ G GATC C
C CTAG G
BclⅠ
T GATC A A CTAG T
杂种位点: T
GATC
C
（BamHⅠ）
A
CTAG
G
（BclⅠ ）
2、酶切片断的末端连接方式：
能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，
并由此切割DNA双链结构的核酸酶。
限制酶的发现
寄主控制的限制(Restriction) 与修饰(Modification)现象：
研究发现：侵染大肠杆
菌的噬菌体在侵染过程 中都存在着一些功能性 障碍。
大肠杆菌K的噬菌体不能侵染大肠杆菌B 反之亦然
大肠杆菌K的噬 菌体不能侵染 大肠杆菌B 反之亦然
• 体外连接的四种方式：
1. 用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断 2. 用T4DNA连接酶将平末端的DNA片断连接； 3a.用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片断 加上poly(A)- poly(T)尾巴后，再用连接酶连接。 3b. 先在DNA片断平末端加上化学合成的衔接物或接 头，形成粘性末端后，再用连接酶连接
例如：Pst1
例如 EcoR1
5’CTGCAG 3’ 3’GACGTC 5’
5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’
Ⅱ、平末端
两条链上的断裂位置处在一个对称结构的中 心，该断裂方式产生具有平末端的DNA片断。 优点：不易重新环化 缺点：连接效率低
同裂酶（isoschizomers)
来源不同 但识别相同靶序列的核酸内切酶。 不同的同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。 但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。
可以通过交换反应标记DNA的5’末端， 用于Maxam-Gilbert法测序、Sl核酸酶分析 及其它须使用末端标记DNA的研究。
作用特点：不受底物分子链的长、短或大、小限制， 单链也可以；
4、DNA连接酶：
能够在NAD+或ATP供能的作用下，使DNA链上 彼此相邻的3’-羟基（OH）和5’-磷酸基团（-P） 形成磷酸二酯键。
Ⅱ型酶
1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中 分离出来的限制酶
特点：
分子量较小（105Da）；只有一种多肽，通常以同源 二聚体的形式存在； 反应只需Mg++的存在 另外两个特点使这类酶在基因工程研究中得到广泛的应用:
识别位点是一个回文对称结构，切割位点也在该回文 对称结构上。
限制与修饰现象的特点： 细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身
的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉
原核生物普遍存在
寄主的R/M体系：
是由两种酶活性配合完成的 一种是起修饰作用的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶
寄主R/M体系的酶学机理
E.coli B含有 Eco B 核酸酶 和 Eco B 甲基化酶 当λ(k)噬菌体侵染E.coli B时，因其DNA序列中 含有Eco B 核酸酶特异识别的碱基序列而被降解掉; 而E.coli B 的DNA中虽然也存在这种特异序列， 但可在Eco B甲基化酶的作用下，催化 S-腺苷甲硫 氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定 碱基，使之甲基化。
4、限制性核酸内切酶的命名原则：
第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个 字母。
第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、 二个字母。 其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。 罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。
例：EcoR I:
来自于Escheria coli RY13的第1个限制酶。
Ⅰ型酶：
1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK 中分离出的核酸内切酶
主要特点：
a.分子量较大， 反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、 ATP等。 b. 兼具限制\修饰两种功能 兼有核酸内切酶\甲基化酶\ATP酶\DNA解旋酶 四种活性
c. 有特异的识别位点但无特异的切割位点， 在基因工程中无应用价值
ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口
3'HO P5' 3'HO P5'
缺口(gap)
切口(nick)
断口(cut)
Nick
Nick
酶－－AMP（腺苷－磷酸） （赖氨酸残基）
磷酸酰胺键
DNA的腺苷酸复合物 3’-OH对P原子作亲核攻击 形成磷酸二酯键
连接酶的作用机理
此反应是由焦磷酸 (ppi)的水解作用激发的 需要花费两个高能磷酸键
EcoB
核酸酶不能识别已甲基化的序列
限制性内切酶
根据酶的功能、大小、反应条件和切割DNA的 特点，可以将限制性内切酶分为三类： Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶
是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶， 其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是 细胞中的一种防御机制用酶 因R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重 要的工具酶。
（calf intestinal alkaline phosphatase CIP）
特点：该酶用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成
为5’-OH（即核酸分子的脱磷酸作用）。
⒊T4多核苷酸激酶（T4
polynucleotide kinase）
主要用途：对缺乏5‘-P的DNA或合成接头进行磷酸化； 可对末端进行标记
基因工程的酶学基础
1、限制性核酸内切酶
2、单链核酸内切酶（S1核酸酶）
主 讲 内 容
3、核酸外切酶
4、修饰酶（末端转移酶、
T4多核苷酸激酶、碱性磷酸酶）
5、DNA连接酶
6、DNA聚合酶
7、核酸探针的标记方法小结
一、限制性核酸内切酶
简称: 限制性内切酶或限制酶
(restriction endonuclease）
1、粘性末端DNA片断的连接
(Nick)
2、平末端DNA片断的连接
1. 用T4DNA连接酶直接进行平末端连接 2. 人工创造“粘性末端”后，再用连接酶连 接。 常用的连接方法：（1）同聚物加尾法、 （2）衔接物法 和（3）接头连接法
同聚物尾巴10~40个碱基
⑴同聚物加尾法
Homopolymer tail-joining
7、核酸内切限制酶对DNA的消化作用
Ⅰ．核酸限制性内切酶以同型二聚体形式与靶序列 发生作用。
Ⅱ．核酸内切限制酶对DNA的消化
完全酶切消化：识别序列n个碱基的核酸内切限制酶，对
DNA的切割能达到每隔4n切割一次的水平。
局部酶切消化：不让核酸内切限制酶对大量的DNA消化完
全，可获得平均分子量大小有所增加的酶切片断产物。
来源：小牛胸腺
特点：a、分子量小，碱性蛋白质， b、在二甲胂酸缓冲液中，能催化5’脱氧核苷三磷酸沿5’－3’ 方向聚合，逐个将dNTPs加到线性DNA分子的3’-OH末端。 c、不需模板，以含3’-OH DNA片段为引物，可在3’-OH端加入 几百个核苷酸。
用途：3’末端标记和多聚物加尾
1. 催化[α-32P]-3’-脱氧核苷酸标记DNA片断的3’末端。 可用于测序的终止(使用不含游离的3’-OH末端的碱基）
许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在DNA上形成粘性末端， 有利于ＤＮＡ片段的重组。
Ⅲ型酶
特点：
a.具有核酸内切酶和甲基化酶活性
b.由两个亚基组成 M亚基: 位点识别与修饰
R亚基 : 具核酸酶活性 c. 可识别特定碱基顺序，并在这一序列的 3’ 端 24-26bp 处切开ＤＮＡ，它的切割位点 也是无特异性的。
2. 催化非放射性的标记物（如，生物素）掺入到DNA片断 的3’-末端，掺入后可产生荧光染料或抗生物素蛋白结 合物的接受位点。
3. 在平头DNA上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端
⒉碱性磷酸酶：
主要用途：核酸分子脱磷酸作用
来源：大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase BAP）或小牛肠
Ⅱ型酶的重要特性
1.在DNA双链上有特异性识别序列，可特异性 切割DNA分子，产生链的断裂 2.通常可形成粘性末端
1、核酸内切酶作用后的断裂方式
Ⅰ、粘性末端 ：两条链上的断裂位置是交错地、
但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂 结果形成具有粘性末端的DNA片断。
具有3’-OH（Pst1）粘性末端； 具有5’-OH (EcoR1)的粘性末端。
同聚物加尾法 和用T4连接酶直接进行的平末端连接法 的缺点：
多数情况下，无法用原来的限制酶作特异性的 切割，从而难以进行下一步的研究。
⑵衔接物连接法
平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进 行处理，人工加上粘性末端。 衔接物的特征：人工合成的小分子DNA，约10-20个核 苷酸，含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。 如：
5、影响核酸内切酶活性的因素：
1.DNA的纯度：
主要是DNase的污染(Mg++) a. 增加核酸内切限制酶的用量， b. 扩大酶催化反应的体系（稀释）， c. 延长酶催化反应的保温时间。 加入亚精胺提高酶的消化作用，需适当的温度。
2. DNA的甲基化程度
3. 酶切消化反应的温度：
大多数酶的标准反应温度 37度。
Ⅲ. 限制酶对真核生物基因组的消化作用
小分子量的片断---分离目的片断 大分子量的片断---构建文库
四、单链DNA核酸内切酶---S1核酸酶：
来源：稻谷曲霉
作用特点：该酶只水解单链DNA，用于将粘性末端
水解成平末端及cDNA发夹式结构的处理。
主要功能：
a、分析核酸杂交分子（RNA-DNA）的结构
1. 反应温度： 连接缺口的温度：37度 连接粘性末端的最佳温度： 4～15度 2. T4DNA连接酶的用量： 平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。 粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。 ATP的用量10μmol-1mmol/L之间 3. 外源片断与载体的浓度的比值（10～20倍）
常用的连接酶：
1.1 DNA连接酶： 大肠杆菌染色体编码的 2.2 T4 DNA连接酶：大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的 DNA连接酶 －－NAD+（辅酶Ⅰ） T4 DNA连接酶 －－ATP 2.3 热稳定的连接酶：嗜热高温放线菌的菌株中分离 例如：TscDNA连接酶（Taq DNA连接酶）
2.4 ……
4. DNA的分子结构：
某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病 毒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高29倍。
6、核酸内切限制酶标准的缓冲液
a. 氯化镁、氯化钠或氯化钾： 不正确的NaCl或Mg++浓度，会降低限制酶的活性， 还可能导致识别序列的改变。 b. Tris-HCl ： 维持最适的pH值（ pH ＝7.4）。 c. β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT） ： 维持酶的稳定性。 d. 牛血清蛋白（BSA）：维持酶的稳定性。
2.2 T4DNA连接酶(T4 DNA ligase）
来源：常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取，由Ｔ４噬菌体
基因组所编码，基因工程中最为常用的连接酶。
主要用途：它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂键的形成，从而使
两个片段以共价键的形式结合起来。
作用底物： 具粘性末端的DNA分子
平末端的DNA分子（效率低）
影响连接酶作用的因素
Example:
HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶 (CCGG) ，当靶序列中出 现一个5-甲基胞嘧啶时，HpaⅡ不能切割，而MspⅠ可 以。
同尾酶（isocaudamer）
来源不同、
识别靶序列不同
但产生相同的粘性末端 （使切割位点的选择余地更大）
Example:
BamHⅠ G GATC C BclⅠ T A GATC CTAG A T
b、打开在双链cDNA合成期间形成的发夹结构等
二、 DNA修饰酶、 DNA连接酶（DNA ligase） 与 分子的体外连接
⒈末端核苷酸转移酶（terminal transferase）
主要用途：同聚物加尾
末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase）
⑴分子间ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ接
⑵分子内连接
3、限制酶的特性
a.限制酶识别的靶序列同DNA的来源无关； b.限制酶识别的靶序列是唯一的（对某种限制酶只具 一个限制位点的质粒） c.-20℃低温下保存 商品化的限制酶多采用50%的甘油缓冲液储存， 避免反复冻融
C
CTAG
G
杂种位点（hybrid site）
由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。 特点：一般不能被原来的任何一种同尾酶识别
BamHⅠ G GATC C
C CTAG G
BclⅠ
T GATC A A CTAG T
杂种位点: T
GATC
C
（BamHⅠ）
A
CTAG
G
（BclⅠ ）
2、酶切片断的末端连接方式：
能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，
并由此切割DNA双链结构的核酸酶。
限制酶的发现
寄主控制的限制(Restriction) 与修饰(Modification)现象：
研究发现：侵染大肠杆
菌的噬菌体在侵染过程 中都存在着一些功能性 障碍。
大肠杆菌K的噬菌体不能侵染大肠杆菌B 反之亦然
大肠杆菌K的噬 菌体不能侵染 大肠杆菌B 反之亦然
• 体外连接的四种方式：
1. 用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断 2. 用T4DNA连接酶将平末端的DNA片断连接； 3a.用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片断 加上poly(A)- poly(T)尾巴后，再用连接酶连接。 3b. 先在DNA片断平末端加上化学合成的衔接物或接 头，形成粘性末端后，再用连接酶连接
例如：Pst1
例如 EcoR1
5’CTGCAG 3’ 3’GACGTC 5’
5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’
Ⅱ、平末端
两条链上的断裂位置处在一个对称结构的中 心，该断裂方式产生具有平末端的DNA片断。 优点：不易重新环化 缺点：连接效率低
同裂酶（isoschizomers)
来源不同 但识别相同靶序列的核酸内切酶。 不同的同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。 但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。
可以通过交换反应标记DNA的5’末端， 用于Maxam-Gilbert法测序、Sl核酸酶分析 及其它须使用末端标记DNA的研究。
作用特点：不受底物分子链的长、短或大、小限制， 单链也可以；
4、DNA连接酶：
能够在NAD+或ATP供能的作用下，使DNA链上 彼此相邻的3’-羟基（OH）和5’-磷酸基团（-P） 形成磷酸二酯键。
Ⅱ型酶
1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中 分离出来的限制酶
特点：
分子量较小（105Da）；只有一种多肽，通常以同源 二聚体的形式存在； 反应只需Mg++的存在 另外两个特点使这类酶在基因工程研究中得到广泛的应用:
识别位点是一个回文对称结构，切割位点也在该回文 对称结构上。
限制与修饰现象的特点： 细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身
的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉
原核生物普遍存在
寄主的R/M体系：
是由两种酶活性配合完成的 一种是起修饰作用的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶
寄主R/M体系的酶学机理
E.coli B含有 Eco B 核酸酶 和 Eco B 甲基化酶 当λ(k)噬菌体侵染E.coli B时，因其DNA序列中 含有Eco B 核酸酶特异识别的碱基序列而被降解掉; 而E.coli B 的DNA中虽然也存在这种特异序列， 但可在Eco B甲基化酶的作用下，催化 S-腺苷甲硫 氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定 碱基，使之甲基化。
4、限制性核酸内切酶的命名原则：
第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个 字母。
第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、 二个字母。 其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。 罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。
例：EcoR I:
来自于Escheria coli RY13的第1个限制酶。
Ⅰ型酶：
1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK 中分离出的核酸内切酶
主要特点：
a.分子量较大， 反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、 ATP等。 b. 兼具限制\修饰两种功能 兼有核酸内切酶\甲基化酶\ATP酶\DNA解旋酶 四种活性
c. 有特异的识别位点但无特异的切割位点， 在基因工程中无应用价值
ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口
3'HO P5' 3'HO P5'
缺口(gap)
切口(nick)
断口(cut)
Nick
Nick
酶－－AMP（腺苷－磷酸） （赖氨酸残基）
磷酸酰胺键
DNA的腺苷酸复合物 3’-OH对P原子作亲核攻击 形成磷酸二酯键
连接酶的作用机理
此反应是由焦磷酸 (ppi)的水解作用激发的 需要花费两个高能磷酸键
EcoB
核酸酶不能识别已甲基化的序列
限制性内切酶
根据酶的功能、大小、反应条件和切割DNA的 特点，可以将限制性内切酶分为三类： Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶
是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶， 其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是 细胞中的一种防御机制用酶 因R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重 要的工具酶。
（calf intestinal alkaline phosphatase CIP）
特点：该酶用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成
为5’-OH（即核酸分子的脱磷酸作用）。
⒊T4多核苷酸激酶（T4
polynucleotide kinase）
主要用途：对缺乏5‘-P的DNA或合成接头进行磷酸化； 可对末端进行标记
基因工程的酶学基础
1、限制性核酸内切酶
2、单链核酸内切酶（S1核酸酶）
主 讲 内 容
3、核酸外切酶
4、修饰酶（末端转移酶、
T4多核苷酸激酶、碱性磷酸酶）
5、DNA连接酶
6、DNA聚合酶
7、核酸探针的标记方法小结
一、限制性核酸内切酶
简称: 限制性内切酶或限制酶
(restriction endonuclease）
1、粘性末端DNA片断的连接
(Nick)
2、平末端DNA片断的连接
1. 用T4DNA连接酶直接进行平末端连接 2. 人工创造“粘性末端”后，再用连接酶连 接。 常用的连接方法：（1）同聚物加尾法、 （2）衔接物法 和（3）接头连接法
同聚物尾巴10~40个碱基
⑴同聚物加尾法
Homopolymer tail-joining
7、核酸内切限制酶对DNA的消化作用
Ⅰ．核酸限制性内切酶以同型二聚体形式与靶序列 发生作用。
Ⅱ．核酸内切限制酶对DNA的消化
完全酶切消化：识别序列n个碱基的核酸内切限制酶，对
DNA的切割能达到每隔4n切割一次的水平。
局部酶切消化：不让核酸内切限制酶对大量的DNA消化完
全，可获得平均分子量大小有所增加的酶切片断产物。
来源：小牛胸腺
特点：a、分子量小，碱性蛋白质， b、在二甲胂酸缓冲液中，能催化5’脱氧核苷三磷酸沿5’－3’ 方向聚合，逐个将dNTPs加到线性DNA分子的3’-OH末端。 c、不需模板，以含3’-OH DNA片段为引物，可在3’-OH端加入 几百个核苷酸。
用途：3’末端标记和多聚物加尾
1. 催化[α-32P]-3’-脱氧核苷酸标记DNA片断的3’末端。 可用于测序的终止(使用不含游离的3’-OH末端的碱基）
许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在DNA上形成粘性末端， 有利于ＤＮＡ片段的重组。
Ⅲ型酶
特点：
a.具有核酸内切酶和甲基化酶活性
b.由两个亚基组成 M亚基: 位点识别与修饰
R亚基 : 具核酸酶活性 c. 可识别特定碱基顺序，并在这一序列的 3’ 端 24-26bp 处切开ＤＮＡ，它的切割位点 也是无特异性的。
2. 催化非放射性的标记物（如，生物素）掺入到DNA片断 的3’-末端，掺入后可产生荧光染料或抗生物素蛋白结 合物的接受位点。
3. 在平头DNA上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端
⒉碱性磷酸酶：
主要用途：核酸分子脱磷酸作用
来源：大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase BAP）或小牛肠
Ⅱ型酶的重要特性
1.在DNA双链上有特异性识别序列，可特异性 切割DNA分子，产生链的断裂 2.通常可形成粘性末端
1、核酸内切酶作用后的断裂方式
Ⅰ、粘性末端 ：两条链上的断裂位置是交错地、
但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂 结果形成具有粘性末端的DNA片断。
具有3’-OH（Pst1）粘性末端； 具有5’-OH (EcoR1)的粘性末端。
同聚物加尾法 和用T4连接酶直接进行的平末端连接法 的缺点：
多数情况下，无法用原来的限制酶作特异性的 切割，从而难以进行下一步的研究。
⑵衔接物连接法
平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进 行处理，人工加上粘性末端。 衔接物的特征：人工合成的小分子DNA，约10-20个核 苷酸，含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。 如：
5、影响核酸内切酶活性的因素：
1.DNA的纯度：
主要是DNase的污染(Mg++) a. 增加核酸内切限制酶的用量， b. 扩大酶催化反应的体系（稀释）， c. 延长酶催化反应的保温时间。 加入亚精胺提高酶的消化作用，需适当的温度。
2. DNA的甲基化程度
3. 酶切消化反应的温度：
大多数酶的标准反应温度 37度。
Ⅲ. 限制酶对真核生物基因组的消化作用
小分子量的片断---分离目的片断 大分子量的片断---构建文库
四、单链DNA核酸内切酶---S1核酸酶：
来源：稻谷曲霉
作用特点：该酶只水解单链DNA，用于将粘性末端
水解成平末端及cDNA发夹式结构的处理。
主要功能：
a、分析核酸杂交分子（RNA-DNA）的结构
1. 反应温度： 连接缺口的温度：37度 连接粘性末端的最佳温度： 4～15度 2. T4DNA连接酶的用量： 平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。 粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。 ATP的用量10μmol-1mmol/L之间 3. 外源片断与载体的浓度的比值（10～20倍）
常用的连接酶：
1.1 DNA连接酶： 大肠杆菌染色体编码的 2.2 T4 DNA连接酶：大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的 DNA连接酶 －－NAD+（辅酶Ⅰ） T4 DNA连接酶 －－ATP 2.3 热稳定的连接酶：嗜热高温放线菌的菌株中分离 例如：TscDNA连接酶（Taq DNA连接酶）
2.4 ……
4. DNA的分子结构：
某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病 毒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高29倍。
6、核酸内切限制酶标准的缓冲液
a. 氯化镁、氯化钠或氯化钾： 不正确的NaCl或Mg++浓度，会降低限制酶的活性， 还可能导致识别序列的改变。 b. Tris-HCl ： 维持最适的pH值（ pH ＝7.4）。 c. β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT） ： 维持酶的稳定性。 d. 牛血清蛋白（BSA）：维持酶的稳定性。
2.2 T4DNA连接酶(T4 DNA ligase）
来源：常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取，由Ｔ４噬菌体
基因组所编码，基因工程中最为常用的连接酶。
主要用途：它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂键的形成，从而使
两个片段以共价键的形式结合起来。
作用底物： 具粘性末端的DNA分子
平末端的DNA分子（效率低）
影响连接酶作用的因素
Example:
HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶 (CCGG) ，当靶序列中出 现一个5-甲基胞嘧啶时，HpaⅡ不能切割，而MspⅠ可 以。
同尾酶（isocaudamer）
来源不同、
识别靶序列不同
但产生相同的粘性末端 （使切割位点的选择余地更大）
Example:
BamHⅠ G GATC C BclⅠ T A GATC CTAG A T
b、打开在双链cDNA合成期间形成的发夹结构等
二、 DNA修饰酶、 DNA连接酶（DNA ligase） 与 分子的体外连接
⒈末端核苷酸转移酶（terminal transferase）
主要用途：同聚物加尾
末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase）