62-EB病毒(EBV)核酸检测标准操作规程(荧光PCR法)
EB病毒（EBV）核酸检测标准操作规程
（荧光PCR法）
1.目的
规范EB病毒核酸DNA（荧光PCR法）检测操作流程，准确进行EB病毒DNA分析。
2.应用范围
使用中山大学达安基因股份有限公司EB病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒（荧光PCR法）和Mx3000P荧光定量PCR仪、Roche480荧光定量PCR仪进行EB病毒DNA检测。
3.职责
由PCR实验室制定程序文件，专业技术人员负责执行，实验室主管负责监督实施。
4.内容
4.1 实验原理及其临床应用
本试剂盒用一对EB病毒（EBV）特异性引物和一条EB病毒（EBV）特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测EB 病毒（EBV）DNA。用于人血中EB病毒DNA的测定，为临床提供参考，
4.2 标本采集
4.2.1 使用标本类型：全血。
4.2.2 标本采集；由合作单位按照以下要求进行采集。
4.2.2.1全血：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入EDTA(乙二胺四乙酸二钠)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。
4.2.3 标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。标本运送采用0℃冰壶。
4.3 试剂准备
4.3.1 供应商：中山大学达安基因股份有限公司。
4.3.2 此实验试剂应放在冰箱-20℃保存，在实验前5分钟取出备用，实验后应立即放回冰箱-20℃。
4.3.3 如果试剂出现了封口蜡破损导致液体外漏以及过期试剂，应及时更换。
4.4 质控品
4.4.1 质控品来源：随试剂盒，由厂家提供。
4.4.2 质控品保存条件：置于-20℃冰箱中保存。
4.4.3 质控频度：每次实验均需做质控。
4.5 操作过程说明
4.5.1 DNA提取
4.5.1.1 质控品处理：取出阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品。8000rpm离心数
秒，吸50ul至0.5ml灭菌离心管中，加入50ulDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理
10±1分钟；12000 rpm离心5分钟，备用。
4.5.1.2 样本处理
4.5.1.2.1 取全血500ul至干燥玻璃试管中，加入生理盐水500ul轻摇混匀；
4.5.1.2.2 取干燥玻璃试管加入1ml淋巴细胞分离液；
4.5.1.2.3 将稀释好的全血用移液器缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中(注意沿着管壁，速度要慢)；
4.5.1.2.4 2000rpm离心20分钟（建议用水平离心机）；
4.5.1.2.5 吸取白细胞层(从上往下第二层)，加入1.5ml离心管，12000rpm离心5分钟；4.5.1.2.6 去上清，沉淀中加入50ulDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；
12000rpm离心5分钟，上清备用。
4.5.2.1 加样：取PCR反应管若干，加入处理后的样品（标本、阴性质控品、临界或强阳性
质控品）上清液5ul,8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。
4.5.3 PCR扩增
将准备好的PCR反应管放置于PCR仪上，编辑样本信息并按下列循环参数进行扩增反应：37℃-2min；94℃-2min；（94℃-15ses；55℃-45ses）×40 cyclics； EBV检测荧光素：FAM; 反应体系：50ul；荧光信号收集：55℃-45ses，末端收集。
4.5.3 Mx3000P荧光定量PCR仪的设置及结果分析
4.5.3.1 打开计算机电源。
4.5.3.2 将Mx3000P电源开关打开，在大约1分钟的时间内，仪器将会自检并且能听到滤镜
轮转动的声音。打开电脑上的Mx3000P软件，确定软件界面右下面的联机标志呈现
绿色。如果不是绿色而是红色，软件会提示
，这时只需要继续稍等片刻，待仪器自检完成，会自动连接计算机。
4.5.3.3 在软件的弹出框中选择您要进行的实验类型，通常选择第
一项“Quantitive PCR（Multiple Standards）”进行绝对定量分析。
4.5.3.4 确定卤钨灯已经打开。(绿色)则说明卤钨灯已经打开；（黄色）则说明卤
钨灯正在预热；（红色）则说明卤钨灯没有被打开，这时需要用鼠标点击这
个标志将光源打开。在卤钨灯已经被打开的情况下，软件界面右下方会显示
（绿色）。
4.5.3.5 最好在仪器与光源预热20分钟后开始实验。
4.5.3.6 在里，对所选孔进行设定，在Well type中设定Standard
（标准品）、NTC（阴性对照）、unkown（样品）等，并选择正确的荧光通道（FAM, HEX, ROX，Cy5），参比荧光（Reference dye）选None。对于标准品，在Well type
中设定为“Standard”后，再设定其模板浓度。方法为：点击
，10倍的浓度梯度可以直接点击
，在下拉菜单中选择不同的系数关系后，依次点击设定为标准品的另外几个孔，浓度将实时显示。也可以直接点击标准品的各个孔位，在
一栏，手工输入浓度。若要对不同的样品进行编号，则双击所选孔，在name框中输入样品号，点击就能显示样品编号。
或者点击版面右上方的，导入以前使用的96孔板设定。
4.5.3.7 点击，进行PCR循环的设定，可以直接点击温度、时间改
变各项温度、时间、循环数等。在选定大步骤之后添加步骤可选定该大步骤后，
点击，或点击鼠标右键，在弹出的对话框中，选择Add Segment，
则可在该大步骤之后添加一个大步骤；若是在选定大步骤里面的小步骤后边添加
一小步骤，选中该小步骤，点击鼠标右键，在弹出的对话框中选择“Add Plateau
with Ramp”。
要删除某个大步骤，直接选定大步骤，点击界面右边的“”，或者点
击鼠标右键选Delete，即可删除该步骤。如果要删除一个大步骤里的小步骤，可
先选定此步骤时间和温度中间的横线，将其变红，如图，点击界面右边的
“”，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该步骤。点击，
导入以前设定的PCR程序。
（END）代表在这一步结束时采集荧光信号；（ALL）代表在这一步的全过程都采集荧光信号，一般用作熔解曲线分析。可直接用鼠标将此图标拖到要采集
信号的地方。若要去除，可将其拖出循环设定区域。
4.5.3.8 结束之后，点击软件界面右上方的。会弹出对话框提示：仪
器灯源正在预热，需要“马上运行”或者是“灯预热完成后再运行”？通常可直
接点击“马上运行”，但最好点击“灯预热完成后再运行”，可以保护灯源。
软件界面右下方会出现运行状态显示框Run Status，点击Start开始实验。在运行
过程中可以通过点击Add Cycles来增加扩增的循环数。还可以选择勾选“Turn lamp
off at end of run”，在PCR运行结束之后软件将自动关闭卤钨灯。
4.5.3.9 在PCR运行的过程中可以点击，观察样品的实时扩增原始结果。
4.5.3.10 PCR运行结束后，点击，再点击Results，软件将自动进行结果分析，
也可点击手动进行结果分析。可以手动调节阈值线（拖动）进行分析。点
击可显示标准曲线，看斜率、截距、线性相关是否在可控范
围内。左下角的可选择相应的荧光观察扩增
曲线。右边的可根据自己的需要选择显示的界面。
是扩增曲线，Ct值列表，标准曲线，样本起始浓度，结果excel表格输出，
合并面板，包括设置、程序设定、样本Ct值、扩增曲线四个面板。
4.5.3.11 分析曲线时，如果曲线不够光滑，还能用中的Smoothing
对曲线进行调节，一般Amplification average是3，可按需要将其调至较大数值，
如5、7、9，调整后曲线将更光滑，不过Ct值会稍微靠后一点，使数据失真，通常情况下，不建议这么做。
4.5.3.12 如果需要对每条曲线进行单独的基线设置，点击中的
Baseline Correction，点击Adaptive baseline，在下面对应的各孔，单独进行
基线起始和终止位置的调节。
4.5.3.13 关于Mx3000P调用前一次实验标准曲线的补充说明。点击桌面Mx3000P的软件图
标，弹出话框：选择Multiple Experiment Analysis （多项实验结果分析）选
项，点击“OK”，出现如下对话框，建议选择“Use common threshold”进行
分析进算，然后点击，导入需要一起分析的上机文件，点击
“Finish”即可。
4.5.3.14 这里选择时要注意：1.两个或者多个实验结果要有相同的实验程序；2.每次程
序中的循环数应该一致。在分析栏可以选择不同实验的不同反应孔进行同步分
析。
4.5.3.15 分析质控结果：
阴性质控品：EBV(FAM)Ct值= 40或“No Ct”。
阳性质控品：EBV（FAM）Ct值<33，且有较好的对数增长曲线。
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新检测。
4.5.3.16 记录实验数据。
4.5.3.17 取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，丢入医疗废物垃圾
桶内，以防止扩增管破裂而导致污染。
4.5.4 Roche480荧光定量PCR仪的设置及结果分析
4.5.4.1 先打开电脑，再打开荧光定量PCR仪器，然后双击图标“”，打开仪器数据库。
4.5.4.2 双击图标“”，启动罗氏480软件。
4.5.4.3 在弹出的对话框中，输入用户名和密码，进入软件设置界面。
4.5.4.4 在弹出的界面中，点击“”，进入新的实验设置
界面：
。
4.5.4.5 在“”菜单栏里，“”子菜单下。
4.5.4.6 将“Detection Format”选择为Daul或3 color的探针杂交类型。
4.5.4.7 将“Reaction Volume”设置为“50ul”。
4.5.4.8 在“Programs”下：通过“”“”来增加总的循环阶段及阶段的循环数，并
在“变性→延伸→退火”循环阶段的“Analysis Mode”下选择Quantification。
4.5.4.9 在“Temperature Targets”下：通过“”“”来增加每个循环阶段里的小
步骤，并在采集荧光的小步骤的“Acquisition Mode”里选择“single”，采集
荧光。
4.5.4.10 在“”菜单栏下，通过“”增加或者减少实验项目类型，通过右边的
孔位选择，设置不同项目的区域，然后点击“Apply”保存。
4.5.4.11 在“”菜单栏下，Step 1处，选择“Abs Quant”；Step 2处，编辑标准品及
样本。
4.5.4.12 标准品设置：在Step 2下的96孔面板中，选中标准品反应孔，然后选择右侧的模
板检测通道，如“483-533”，然后将下方孔位的“Quantification Sample Type”
选择为“Standard”，并在“Concentration”处输入其浓度即可。
4.5.4.13 样本设置：类似于标准品设置，但仅需要编辑其“Sample Name”即可。
4.5.4.14 返回“”菜单，在“”子菜单右下角点击
“”，运行实验。
4.5.4.15 实验结束后，在“”菜单下，选择“Abs Quant/Fit Points”，进入结果分
析界面：
【Analysis】：在此菜单下对阈值线进行调整；
【Noise Band】：对实验的信噪比进行调整；
【Filter Comb】：对不同荧光通道进行选择；
【Std Curve】：对定量参考品进行选择，包括实验中的参考品、导入的标准品等；
4.5.4.16 在上述操作完成后，点击“”；在“”菜单中，根据需要选择
报告中需包含的项目，然后得出结果。
4.5.4.17 分析质控结果：
阴性质控品：EBV(FAM)Ct值= 40或“No Ct”。
阳性质控品：EBV（FAM）Ct值<33。
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新检测。
4.5.4.18 记录实验数据。
4.5.4.20 取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，丢入医疗废物垃圾
桶内，以防止扩增管破裂而导致污染。
4.5.4.21 关闭扩增仪电源和计算机电源。
4.6 结果判定
EBV阳性：（EBV-FAM）Ct≤36，且有较好的对数增长曲线。
EBV阴性：（EBV -FAM）Ct值=40或者“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI 7500)。
EBv检测灰度区：（EBV -FAM）36 素，应重复检验确认。 4.7 参考值：阴性。 4.8 注意事项 4.8.1 PCR荧光定量检测法比较容易受污染，所以实验过程中应尽量避免反复开盖，所用耗 材均需高压灭菌。 4.8.2 试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融。 4.8.3 实验完毕应用有效氯终浓度为2000mg/L的消毒液擦拭桌面，并打开紫外线灯消毒。 本作业指导书颁发部门: 质管部 本作业指导书分发部门：PCR室 本作业指导书编写人: 编写日期：年月日本作业指导书审核人：审核日期：年月日 本作业指导书审批人: 执行日期：年月日 甲型乙型流感病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）操作规程 1 目的：规范操作流程，确保检测结果的准确性可靠性。 2 范围：甲型/乙型流感病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法） 3 操作人：甲型/乙型流感病毒核酸检测人员对此规程负责 4 内容： 4.1 核对本次实验所有标本与申请单对应的编号，统计本次实验标本总数，确定所需实际量。实际检测数量为所需检测样本数量和阴阳对照品总和。 4.2 试剂准备： 4.2.1 进入试剂准备区，更换本区实验服和实验鞋，戴上手套、口罩。 4.2.2 打开照明灯，从冰箱中取出本次实验所需试剂。 4.2.3 打开超净工作台，在废液缸中加入新鲜配置的10%的次氯酸钠溶液。 4.2.4 取出本次实验所需耗材，如离心管、离心管架、吸头。将试剂盒中的核酸扩增反应液、酶混合液、检测液、阳性对照、空白对照、DNA提取液取出，置于离心管架上。待室温溶解后，瞬时离心，备用。 4.2.5 根据样本量计算需准备检测试剂人份数N（N=样本数+阳性对照+空白对照）。 4.2.6 按比例（核酸扩增反应液7.5μl/人份+酶混合液5μl/人份+甲型/乙型流感病毒反应液4μl/人份+去RNA酶水 3.5μl/人份）将各组分在离心管中混匀后瞬时离心，配置成PCR-mix，并按20μl/管依次分装到对应编号PCR八连管中。 4.2.7 将分装好的PCR-mix盖上PCR板盖，放到传递窗，收拾好试验台，将垃圾桶内的废弃物丢弃到医疗垃圾桶中并用10%的次氯酸钠溶液清洗干净，将移液器调回最大量程，换下本区工作服。 4.3 样本处理： 4.3.1 进入样本处理区，更换本区实验服和实验鞋，戴上手套、口罩。 4.3.2 开启生物安全柜照明灯，将样本、试剂、分装好的PCR-mix放入生物安全柜内，在废液缸中加入新鲜配置的10%的次氯酸钠溶液。 4.3.3 取200μl的待测样本、阳性对照、弱阳性对照和空白对照用病毒核酸提取试剂盒提取核酸。 本试剂盒的阳性对照、弱阳性对照、空白对照参与提取，用于对环境的监控和试剂的质控。 4.3.4 小心打开PCR八联管盖，每份待测样本核酸溶液、阳性对照、弱阳性对照和空白对照按照5μl/管依次加入对应编号的PCR八联管中，总体积为25μl/管。 4.3.7 盖紧PCR八联管盖，做好标记，低速短暂离心，置于反应管架上，放到去检测室的传递窗。 4.3.8 收拾好生物安全柜，将垃圾桶内的废弃物丢弃到医疗垃圾桶中并用10%的次氯酸钠溶液清洗干净，将移液器调回最大量程，换下本区工作服。 4.4 PCR扩增检测 4.4.1 进入样本处理区，更换本区实验服和实验鞋，戴上手套、口罩。 4.4.2 将反应管和管架带入核酸扩增区，按《ABI7500荧光定量PCR仪的使用维护标准操作程序》的相关程序操作。 4.4.3 循环参数设定 注：ABI7500实时荧光PCR仪不选 ROX 校正，淬灭基团选 None。 EB病毒（EBV）核酸检测标准操作规程 （荧光PCR法） 1.目的 规范EB病毒核酸DNA（荧光PCR法）检测操作流程，准确进行EB病毒DNA分析。 2.应用范围 使用中山大学达安基因股份有限公司EB病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒（荧光PCR法）和Mx3000P荧光定量PCR仪、Roche480荧光定量PCR仪进行EB病毒DNA检测。 3.职责 由PCR实验室制定程序文件，专业技术人员负责执行，实验室主管负责监督实施。 4.内容 4.1 实验原理及其临床应用 本试剂盒用一对EB病毒（EBV）特异性引物和一条EB病毒（EBV）特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测EB 病毒（EBV）DNA。用于人血中EB病毒DNA的测定，为临床提供参考， 4.2 标本采集 4.2.1 使用标本类型：全血。 4.2.2 标本采集；由合作单位按照以下要求进行采集。 4.2.2.1全血：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入EDTA(乙二胺四乙酸二钠)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。 4.2.3 标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。标本运送采用0℃冰壶。 4.3 试剂准备 4.3.1 供应商：中山大学达安基因股份有限公司。 4.3.2 此实验试剂应放在冰箱-20℃保存，在实验前5分钟取出备用，实验后应立即放回冰箱-20℃。 4.3.3 如果试剂出现了封口蜡破损导致液体外漏以及过期试剂，应及时更换。 4.4 质控品 4.4.1 质控品来源：随试剂盒，由厂家提供。 PCR实验室可以开展这些检验项目 PCR实验室又叫基因扩增实验室，PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称。是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA 复制。通过DNA基因追踪系统，能迅速掌握患者体内的病毒含量，其精确度高达纳米级别。 在新冠疫情之前，大多数PCR实验室集中在大型三级甲等医院，因其建设成本高、人员素质要求高，实验室运营成本高，常规检测样本量少等特点，很多二级医院并没有建设。 在国家政策和疫情发展的推动下，各地二级及以上医疗机构都已经建立独立合规的PCR实验室，实验室人员经过3年疫情的“锤炼”，也已经初步具备了符合岗位要求的素质。 如今防控政策已迎来重大调整，“遍地开花”的PCR实验室还能做些什么呢？本文为大家整理介绍PCR实验室可开展的检验项目。 一、感染性疾病分子检验项目 1.乙肝病毒核酸检测 利用实时荧光定量PCR以定量检测HBV DNA，从而对HBV感染做出快速早期诊断。用于HBV感染的辅助诊断和乙型肝炎患者药物治疗的疗效监控。 2.乙肝病毒基因分型检测 国内HBV基因型中约60%为C型基因，30%为B型基因。应用PCR结合Taqman技术，检测B/C型HBV特异性DNA核酸片段。可以结合临床表现和其它实验室检测指标对患者病情进行评价。 3.丙肝病毒核酸检测 利用实时荧光定量PCR 检测技术，通过荧光信号的变化实现HCV RNA 的定量检测。用于HCV感染的辅助诊断和丙型肝炎患者药物治疗的疗效监控。 4.丙肝病毒基因分型 应用PCR结合Taqman技术，对1b型、2a型HCV的特异性RNA核酸片段进行检测。可以对标本进行HCV的基因 乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）核酸检测 试剂盒（PCR-荧光法）操作规程 1.目的 规范核酸检测试验操作，确保检测结果的准确性。 2.原理 2.1 汇集：吸取8份（或以下）样品到指定的汇集管。 2.2提取：病毒核酸提取的方法为磁珠法。试剂盒提供之内对照(IC)为不具感染性的假病毒，在进行样品核酸提取前加入样品中，监控提取、扩增和分析的全过程。标本经裂解液处理后会将病毒外鞘膜破坏，蛋白质变形，使病毒裂解释放出病毒基因组核酸。加入表面包被有二氧化硅的磁珠颗粒，在高盐环境下带负电荷的核酸吸附到带正电荷的的磁珠颗粒表面。洗液可以洗去未结合的物质，如变性的蛋白、细胞碎片、PCR抑制物等并降低盐浓度。纯化的病毒在特定的环境下从磁珠颗粒表面洗脱下来成为扩增的模板。 2.3扩增：采用PCR扩增TaqMan荧光探针标定技术同时对HBV（DNA）、HCV （RNA）、HIV（RNA）进行检测。在反转录酶的作用下HCVRNA、HIVRNA反转录成cDNA，再与HBVDNA一同通过TaqDNA聚合酶的作用扩增病毒核酸的保守区域，TaqDNA聚合酶5`—3`外切酶活性切割反应系统中带荧光标记的 TaqMan探针，随着PCR的进行，荧光信号不断积累。通过PCR仪的检测血液标本达到和超过荧光阈值的信号给出样品的阴阳性结果。 选择性PCR扩增：采用UNG-dUTP抗污染系统。在PCR扩增系统中采用UTP代替TTP，产生大量U-DNA片段。UNG酶特异识别U-DNA片段中含UTP的位点并进行切割，U-DNA被降解后不能作为再次扩增的模板，系统选择性的扩增天然的核酸分子，从而防止了PCR扩增产物的污染。 2.4 质量控制原理 为监控实验进行，保证实验结果的准确，在每次检测过程依靠阳性、阴性质控品以及内标进行监测。 2.4.1阴性质控品监控系统性假阳性，如果阴性质控品检测结果为阳性，说明实验存在假阳性的风险，因此实验中的阳性结果需复查。 2.4.2低浓度阳性质控品监控系统假阴性，如果低浓度阳性质控品检测结果为阴性，说明实验存在假阴性或灵敏度下降的风险，因此实验中的阴性结果均需复测。 2.4.3内对照分为DNA内对照和RNA内对照，是每个反应管中的阳性质控，用 P C R-H P V-D N A荧光定量检测标准操作程序(总4页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1 -CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除 1.目的：明确高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的操作规程，指导检验人员正确进行巨细胞病毒核酸定量的检测。 2.适用范围： 适用于进行高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的检验人员。 适合仪器：LightCycler480型核酸扩增荧光检测仪 方法原理：采用PCR方法结合荧光探针的扩增技术 样品要求：宫颈脱落细胞 3.职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。 4.试剂来源：潮州凯普生物化学有限公司高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测试剂盒。 5.质控物：阴性、阳性对照及阳性参控品系列均来源于试剂盒 6.标准操作： 试剂准备（在试剂准备区操作） 将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻（临用前取出，用后立即放回冰箱，反复冻融不可超过三次），取出PCR MIX,室温下避光解冻，上下颠倒混匀后，8000转/分钟10s从试剂盒中取出DVA聚合酶，8000转/分钟lOs。 根据当次实验标本量，取出相应试剂（1管= MIX + DVA聚合酶）总的需求量于一管中（其余随即放回原温度保存），如所需要的管数为n (n=标本数+1空白管对照+1管阳性对照) 取PCR反应管转移至样本制备区。 样本处理(在样本处理区进行) 取宫颈脱落细胞样本0. 5ml~1ml(如果细胞数量少可以加大体积到2m1) 13000转/分钟离心1分钟 弃上清，加入细胞保存液重悬细胞 13000转/分钟离心1分钟，尽量弃干净上清 每样本加入50ul细胞裂解液，充分振荡重悬细胞，煮沸10分钟。 13000转/分钟离心10分钟，保留上清备用(上清中为释放的DNA)。 取上清作为PCR扩增的模板，其余保存于一20℃ 在对应的PCR反应管中分别加入2ul处理好的样本DVA,空白对照、阳性对照，盖 紧管盖，稍做离心(反应总体积为2o u 1/人份，每次反应需要设置一个阳性对照以及一个空白对照)。转移到检测区，放入相应的荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序 PCR扩增（在扩增区操作） 打开稳压器电源，再打开计算机电源。 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。 设置四种荧光检测通道的报告荧光、淬灭荧光;Passive Reference选择none(见表 1) 表1: 设置四种荧光检测通道 EBV实验室检测方法之面面观（一） EBV (Epstein-BarrVirus)， 是一种嗜人B淋巴细胞的双链DNA 病毒，属于疱疹病毒科。 人是EB病毒的感染宿主，病毒主要通过唾液传播，也可通过输血途径传播。EBV感染呈全球性分布，90%以上的成人血清EBV抗体阳性，感染者终身携带病毒。在我国，EBV主要感染群体为学龄前儿童。 EBV作为儿童感染性疾病常见的病原体，几乎可以危害所有脏器和组织，甚至发展为一些危及生命的疾病，常见的有传染性单核细胞增多症（IM）、慢性活动性EBV感染（CAEBV）以及EBV相关噬血组织细胞增生症（HLH）。该病毒还被认为是多种恶性肿瘤的病因之一，如鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃癌等，每年EBV 相关肿瘤死亡病例达15-20万。此外，还有多种儿科疾病中也查到EBV感染，如与免疫功能受损相关的平滑肌肉瘤、川崎病、肾小球肾炎、病毒性心肌炎、心包炎、急性特发性血小板减少性紫癜、病毒性脑炎、呼吸系统感染等疾病。 EBV感染的主要临床症状包括发热、全身淋巴结肿大、肝脾肿大以及皮肤黏膜疹等，多数并不典型。因此EBV的确诊需要依靠实验室诊断，目前主要的实验室诊断方法包括：嗜异凝集抗体检测、外周血异型淋巴细胞比例检测、EBV特异性抗体检测、EBV核酸检测以及EBERS原位杂交等，国内以EBV特异性抗体检测应用最为广泛。 1 嗜异凝集抗体检测 嗜异性抗体的检测方法主要为试管法和血凝反应板法。在成人和青少年有85%-90%的EBV感染者会出现嗜异凝集抗体，一般在2-5周达到高峰，然后迅速下降。但是在2-5岁的儿童EBV感染者中，嗜异性抗体阳性率仅有50%，在1-2岁的儿童中为10%-30%。此外，该方法特异性欠佳，因此在儿童EBV感染诊断中应用有限。 2 外周血异型淋巴细胞比例 通常将外周血异型淋巴细胞比例≥10%作为单独的诊断指标，而学龄前儿童异型淋巴细胞比例很低，因此对该年龄段诊断意义不大。 3 荧光定量PCR检测EBV核酸 RT-PCR是目前监测EBV载量最主要的方法。外周血单个核细胞中，EBV核酸阳性可持续6个月，单纯EBV-DNA检测只能提示机体存在活动性EBV感染以及病毒活动性复制，不能确定原发性感染或既往感染、再激活，因而在IM中诊断价值有限。在免疫缺陷患者EBV原发感染诊断以及抗体检测结果难以解释时可能有所帮助，另外该方法可用于指导治疗和判断疗效。 4 EBERS原位杂交 EBV潜伏感染的细胞中含有大量的EBERS，因此能够定位EBV感染的细胞。活检组织样本中（包括肿瘤）的EBERS阳性是诊断疾病是否与EBV有关的金标准。 5 EBV特异性抗体检测 EBV感染不同时期，机体会产生针对不同抗原的特异性抗体。依据EBV特异性抗体谱，可分为原发感染、既往感染和再激活３种类型。感染时期的确定对相关疾病的诊断具有非常重要的临床意义。但是由于机体对病毒的免疫反应十分复杂，必须要联合多项抗体检测以及IgG亲合力检测，才能准确判断感染阶段，辅助临床诊断和治疗。 荧光定量pcr仪规程浙-概述说明以及解释 1.引言 1.1 概述 概述 荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）仪是一种基因检测仪器，利用PCR技术和荧光探针技术相结合，可以对DNA进行定量检测。相比于传统的PCR仪，荧光定量PCR仪具有更高的灵敏度和准确性。 本文将介绍荧光定量PCR仪的原理、操作流程以及实验注意事项，帮助读者更深入地了解这一先进的基因检测仪器的使用方法和注意事项。同时，我们也将探讨荧光定量PCR仪的应用前景和展望，展示其在生物医学领域的重要性和潜力。 1.2 文章结构 本文主要包括三个部分：引言、正文和结论。 - 引言部分主要介绍了荧光定量PCR仪的概述、文章结构和目的，为读者提供了对本文内容的整体了解。 - 正文部分将详细介绍荧光定量PCR仪的原理、操作流程和实验注意 事项，帮助读者了解该仪器的工作原理和正确操作步骤。 - 结论部分对本文进行总结，探讨荧光定量PCR仪在实验中的应用前景，并展望该技术可能的发展方向，为读者提供对该技术的进一步思考和研究方向。 1.3 目的 荧光定量PCR仪是一种用于测定DNA或RNA特定序列数量的仪器，其主要目的是通过扩增和检测目标DNA或RNA的数量，从而实现对其定量分析。本文旨在介绍荧光定量PCR仪的操作规程，以帮助使用者正确、高效地操作该仪器。通过本文的介绍，读者将了解荧光定量PCR仪的原理、操作流程以及实验注意事项，从而能够更好地利用该仪器进行实验研究，提高实验效率和准确性。希望本文能够为使用荧光定量PCR仪的科研人员提供实用的指导，并促进该技术在科研领域的应用和发展。 2.正文 2.1 荧光定量PCR仪的原理 荧光定量PCR仪是一种用于检测PCR反应过程中DNA分子数量的仪器。其原理基于PCR技术和荧光探针技术的结合。 首先，PCR技术是一种在体外扩增DNA片段的方法，通过PCR反应 AGS8830-8/16型实时荧光定量PCR 仪操作规程 1.目的 规范AGS8830-8/16型实时荧光定量PCR仪使用操作过程，确保仪器的正常运转和检测结果的准确。 2.范围 2.1该产品基于荧光聚合酶链式反应（PCR），与配套的核酸检测试剂共同使用，在临床上可 对来源于人体的核酸样本（RNA/DNA）进行定量、定性检测， 2.2包括病原体和人类基因项目。 3.职责 3.1 科主任 3.1.1 负责审核制定AGS8830-8/16型实时荧光定量PCR仪操作规程； 3.1.2 负责AGS8830-8/16型实时荧光定量PCR仪日常使用、保养的监督和管理。 3.2 仪器负责人 3.2.1 负责起草AGS8830-8/16型实时荧光定量PCR仪操作规程； 3.2.2 指导和监督AGS8830-8/16型实时荧光定量PCR仪日常使用和保养，遇特殊情况及时 报告。 3.3 仪器操作人员 3.3.1 负责AGS8830-8/16型实时荧光定量PCR仪使用操作； 3.3.2 负责AGS8830-8/16型实时荧光定量PCR仪日常维护、保养和仪器故障报修申请。 4.实验环境温度 4.1 本仪器应在室内使用，放置仪器的工作台应水平、稳固。 4.2 仪器要求在海拔2000 米以下使用。 4.3 本仪器应安装在湿度较低、灰尘较少并远离水源（如水池、水管等）的地方，室内应 通风良好，无腐蚀性气体或强磁场干扰。不要将仪器安放在潮湿或灰尘较多的地方。 4.4 本仪器上的开口都是为了通风而设，为了避免温度过热，一定不要阻塞或覆盖这些通 风孔。单台仪器使用时，仪器四周的通风孔与最近物体的距离应不小于30cm。多台仪 器同时使用时，每台仪器之间的距离应不小于50cm。 4.5 温度过高会影响仪器的检测性能或引起故障。不要在阳光和强光源直射的地方使用本 仪器，以免影响仪器荧光检测，并应远离暖气、炉子以及其它一切热源。 4.6 环境温度：10～30℃相对湿度：10～85％ 5. 操作步骤 5.1开机前的检查 5.1.1在接通电源以前，应先确认以下内容：电源是否与系统要求相符合；确认电源线插头 已正确、可靠的插入电源插座中；确认仪器后侧的升级开关是否处于下端“Normal”位置；周围工作环境、仪器的放置条件是否符合要求；开机后热盖预热2min。 5.2 开机启动界面 5.2.1开机自检通过进入启动界面. EB病毒感染的核酸检测：标本类型的选择 郭建巍 【摘要】近年来的研究表明,EB病毒(epstein-barr virus,EBV)感染与多种疾病的 发生有密切的关系.由于EB病毒独特的感染方式,其实验室诊断特别是核酸检测显 得尤为重要.本文就EB病毒的生物学特性、感染方式、抗体产生,特别是核酸检测 中标本类型的选择、标准化以及未来的检测方向等问题进行了述评和展望,以期为EB病毒感染相关疾病的诊断和预后评判提供更准确的核酸检测结果. 【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》 【年(卷),期】2016(008)003 【总页数】5页(P145-149) 【关键词】EB病毒;标本;血浆;外周血单个核细胞 【作者】郭建巍 【作者单位】海军总医院检验科,北京100048 【正文语种】中文 ★通讯作者：郭建巍，E-mail：************** EB病毒（epstein-barr virus，EBV）即人类疱疹病毒Ⅳ型（human herpesvirus type 4），是一种常见的人类疱疹病毒。EBV初次感染后就终生定居在B细胞中。据文献报道，约90%以上的成人EB病毒血清学反应阳性，提示在儿童或青少年时感染过EB病毒［1］。 近年来大量研究证明，EBV与人群鼻咽癌、何杰金病、T/NK细胞淋巴瘤 （T/Natural killer cell lymphoma）、Burkitt淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma）、乳腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤发生、发展相关，还与免疫抑制剂使用患者和多种免疫缺陷性疾病患者移植后淋巴细胞增殖性异常（post-transplant lymphoproliferative disorders，PTLD）、移植后平滑肌肿瘤、获得性免疫缺陷综合症（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）相关性淋巴瘤、多发性硬化、原发性中枢神经系统淋巴瘤或平滑肌肉瘤密切相关［2-7］。由于EBV广泛的疾病谱，EBV已成为许多学者研究和关注的焦点。 在EBV感染的临床诊断中，临床医生必须要弄清楚几个问题：患者是否感染EBV？EBV感染处于什么时相？是否为EBV的活动性感染？所患疾病是否与EBV感染相关？只有弄清楚了这几个问题，才能对EBV相关疾病的诊疗有一个全面而整体的 认识，才好有的放矢、对症治疗。而要回答这些问题，就必须要了解EBV的生物 学特性及其特殊的感染形式。本文就EBV生物学特性及感染方式、EBV感染类型 及免疫相关指标、感染后的实验诊断指标、核酸检测标本类型的选择、标准化等问题进行讨论，以期为EBV感染相关疾病的诊断和预后评判提供科学依据（表1）［8］。 EBV是线性双链嗜B细胞DNA病毒，基因组长172 kb，包括编码衣壳抗原（viral capsid antigen，VCA）、早期抗原（early antigen，EA）和核抗原（nuclear antigen，NA）的基因。EBV基因组大部分是相同的，在编码EBV核 抗原（EBV nuclear antigen，EBNA）2，EBNA 3A，EBNA 3B及EBNA 3C的 基因亚型中存在一些等位基因多态性的亚型，Ⅰ型在西方国家和东南亚居多，非洲地区Ⅰ型和Ⅱ型同时存在。 人是EBV感染的惟一宿主，由于B细胞表面有EBV受体分化群抗原21（cluster of differentiation antigen，CD21）分子，EBV能直接感染侵入B细胞并使其永生化，或以郎罕氏细胞介导的方式感染口咽部上皮细胞，入血后再感染B淋巴细 新冠核酸单检样本检测标准操作规程 1.检验目的 体外定性检新冠(2019-nCoV)ORF1ab和N基因，用于新冠感染的体检筛查。 2.检测原理与方法 对新冠(2019-nCoV)ORF 1ab及编码核衣壳蛋白N基因的特异性保守序列为靶区域,进行了双靶标基因的设计,配以 PCR 反应液,在荧光定量PCR仪上,应用实时荧光定量RT-PCR 检测技术,通过荧光信号的变化实现样本RNA的检测。 PCR检测体系包含有内源性的内标引物和探针,通过检测内标是否正常来监测样本采集、提取过程,避免假阴性结果。 3.职责 保证分子生物组实验室对于新冠(2019-nCoV)筛查检测结果的可靠性。 4.性能特征 4.1准确性 检测企业阳性参考品,结果均为阳性。
4.2特异性 本试剂盒与冠状病毒(NL63,HKU1,229E,OC43)、SARS 冠状病毒、MERS 冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒Yamagata 型、Victoria 型、甲型H1N1流感病毒、甲型 H3N2 流感病毒、甲型H5N1 流感病毒、甲型 H7N9 流感病毒、呼吸道合胞病毒 A、B 型、鼻病毒 A、B、C 型、腺病毒 1、2、3、4、5、7、55型、副流感病毒1、2、3 型、肠病毒A、B 型、肠病毒 C 型(EV-C95)、肠病毒 D 型(EV-D70)、偏肺病毒、人间质肺病毒、新生隐球菌、化脓性性链球菌、鲍曼不动杆菌、肺孢子虫、肺炎克雷伯杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎衣原体、EB 病毒、人巨细胞病毒、烟曲霉、白色念球菌、光滑念珠菌、结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、诺如病毒、轮状病毒、水痘-带状疱疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人类基因组 DNA 等阳性样本无交叉反应。检测企业阴性参考品均为阴性。
4.3精密度 批内精密度 Ct 值的变异系数(CV,%)≤5%。
4.4 最低检测限 本试剂盒最低检测限为200 copies/mL。 人民医院基因扩增实验室EB病毒核酸定量检测标准操作程序 1 项目名称 单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测 2 检验方法名称 TaqMan荧光定量检测 3 方法学原理 用一对EB病毒特异性引物和一条EB病毒特异性荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基团的荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。 4 标本要求 4.1 适用标本类型：全血。 4.2 标本采集 a ) 全血：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注 入含EDTA（乙二胺四乙酸二钠）或枸橼酸钠抗凝剂的玻 璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5～10次，使抗凝剂与静 脉血充分混匀，密闭送检。 5 试剂 5.1 试剂名称：EB病毒病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 5.2 生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司； 5.3 试剂货号：#DA-B065； 5.4 包装规格：20人份/盒； 5.5 试剂成份： 5.6 试剂储存条件：保存于—20℃，有效期6个月。 6 仪器 ABI 7500全自动基因扩增检测仪 7 操作步骤 7.1 DNA提取 7.1.1 阴性质控品处理 a ) 取出阴性质控品，8,000rpm离心数秒，吸50μl至0.5ml 灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟； b ) 12000r/min离心5min，备用。 7.1.2 标本处理 7.1.2.1 全血 a ) 取全血1ml至干燥玻璃试管中，加入生理盐水1ml轻摇混 匀； b ) 取干燥玻璃试管卷入500µl淋巴细胞分离液； 超全统计！PCR实验室经常开展的检验项目介绍， 从此再也不求人！ PCR实验室又叫基因扩增实验室，PCR是聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)的简称。是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。通过DNA基因追踪系统，能迅速掌握患者体内的病毒含量，其精确度高达纳米级别。 在新冠疫情之前，大多数PCR实验室集中在大型三级甲等医院，因其建设成本高、人员素质要求高，实验室运营成本高，常规检测样本量少等特点，很多二级医院并没有建设。 在国家政策和疫情发展的推动下，各地二级及以上医疗机构都已经建立独立合规的PCR实验室，实验室人员经过2年多疫情的“锤炼”，也已经初步具备了符合岗位要求的素质。 新冠疫情终会结束，除了新冠核酸检测，“遍地开花”的PCR实验室还能做些什么呢？本文为大家整理介绍PCR实验室可开展的检验项目。 一、感染性疾病分子检验项目 1.乙肝病毒核酸检测 利用实时荧光定量PCR以定量检测HBVDNA，从而对HBV感染做出快速早期诊断。用于HBV感染的辅助诊断和乙型肝炎患者药物治疗的疗效监控。 2.乙肝病毒基因分型检测 国内HBV基因型中约60%为C型基因，30%为B型基因。应用PCR 结合Taqman技术，检测B/C型HBV特异性DNA核酸片段。可以结合临床表现和其它实验室检测指标对患者病情进行评价。 3.丙肝病毒核酸检测 利用实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现HCVRNA 的定量检测。用于HCV感染的辅助诊断和丙型肝炎患者药物治疗的疗效监控。 4.丙肝病毒基因分型 应用PCR结合Taqman技术，对1b型、2a型HCV的特异性RNA核酸片段进行检测。可以对标本进行HCV的基因分型，结合临床表现和其它实验室检测指标对患者病情进行评价。 5.结核分枝杆菌DNA定量检测 应用PCR结合Taqman技术，对TB的特异性DNA核酸片段进行荧光检测，从而对TB感染做出快速早期诊断。用于TB感染的辅助诊断和药物治疗的疗效监控。 6.EB病毒DNA定量检测 应用PCR结合Taqman技术，采用EBV特异性引物探针，对EBVDNA 进行荧光PCR检测。用于EBV感染的辅助诊断和其它感染患者药物治疗的疗效监控。 7.巨细胞病毒DNA定量检测 应用PCR结合Taqman技术，对CMV特异性DNA核酸片段进行荧光检测，从而对CMV感染做出快速早期诊断。用于CMV感染的辅助诊断和药物治疗的疗效监控。 8.单纯疱疹病毒DNA定量检测 应用PCR结合Taqman技术，采用HSV特异性引物探针，分别对HSV1型和2型的特异性DNA核酸片段进行荧光PCR分型检测，从而对HSV感染做出快速早期诊断。用于HSV感染的辅助诊断和药物治疗的疗效监控。 9.肺炎支/衣原体DNA定量检测 应用PCR结合Taqman技术，对MP和CP的特异性DNA核酸片段同时进行荧光PCR检测，从而对MP、CP感染做出快速早期诊断。用于MP、CP感染的辅助诊断和药物治疗的疗效监控。 10.淋球菌核酸检测 淋球菌核酸检测分为核酸提取和恒温扩增。适用于定性检测男性尿道拭子标本、女性宫颈拭子标本中的淋球菌RNA。检测结果可用于淋球 PCR实验室可开展的检验项目介绍 PCR实验室又叫基因扩增实验室，PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称。是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。通过DNA 基因追踪系统，能迅速掌握患者体内的病毒含量，其精确度高达纳米级别。 在新冠疫情之前，大多数PCR实验室集中在大型三级甲等医院，因其建设成本高、人员素质要求高，实验室运营成本高，常规检测样本量少等特点，很多二级医院并没有建设。 在国家政策和疫情发展的推动下，各地二级及以上医疗机构都已经建立独立合规的PCR实验室，实验室人员经过2年多疫情的“锤炼”，也已经初步具备了符合岗位要求的素质。 新冠疫情终会结束，除了新冠核酸检测，“遍地开花”的PCR实验室还能做些什么呢？本文为大家整理介绍PCR实验室可开展的检验项目。 一、感染性疾病分子检验项目 1.乙肝病毒核酸检测 利用实时荧光定量PCR以定量检测HBV DNA，从而对HBV感染做出快速早期诊断。用于HBV感染的辅助诊断和乙型肝炎患者药物治疗的疗效监控。 2.乙肝病毒基因分型检测 国内HBV基因型中约60%为C型基因，30%为B型基因。应用PCR结合Taqman技术，检测B/C型HBV特异性DNA核酸片段。可以结合临床表现和其它实验室检测指标对患者病情进行评价。 3.丙肝病毒核酸检测 利用实时荧光定量PCR 检测技术，通过荧光信号的变化实现HCV RNA 的定量检测。用于HCV感染的辅助诊断和丙型肝炎患者药物治疗的疗效监控。 4.丙肝病毒基因分型 应用PCR结合Taqman技术，对1b型、2a型HCV的特异性RNA 核酸片段进行检测。可以对标本进行HCV的基因分型，结合临床表现和其它实验室检测指标对患者病情进行评价。 5.结核分枝杆菌DNA定量检测 应用PCR结合Taqman技术，对TB的特异性DNA核酸片段进行荧光检测，从而对TB感染做出快速早期诊断。用于TB感染的辅助诊断和药物治疗的疗效监控。 6.EB病毒DNA定量检测 应用PCR结合Taqman技术，采用EBV特异性引物探针，对EBV DNA进行荧光PCR检测。用于EBV感染的辅助诊断和其它感染患者药物治疗的疗效监控。 7.巨细胞病毒DNA定量检测 PCR荧光检测试剂盒生产质量控制规程 一. 微量加样器的使用规定 1．微量加样器校正：: 使用微量加样器吸10μl 10次是否为100μl。 2．加样前吸头润湿：当吸头排空时，仍会有一些残留的液体以薄膜的形式吸附在吸头里面，所以，在加样时先吸打液体数次，充分润湿吸头管腔,以保证加样的一致性。 3．加样时吸头应靠试管壁：加样时吸头的液体顺着管壁流出，防止液滴的形成由于其表面张力的作用而阻止样本的释放。 4．吸头是否与加样器上吸头套筒密封：样器上吸头与套筒密封完好。 5．加样时注意第一停点和第二停点：吸液是应注意大拇指按下按钮至第一停点，缓慢慢慢吸入液体。停留1s，然后将吸头提离液面。用吸纸抹去吸嘴外面可能黏附的液滴。放液时经过第一停点，停1-2s后，继续按压到第二停点，排出残余液体。 6．PCR反应原液由于有甘油在冷的状态较黏稠,易于1次吸取数人份，慢一些。 7．边加边看,直观估计,防止跳管。 8．低温冷藏批量DNA提取液、PCR反应液A和B取出时是否充分混匀后,分装使用，PCR反应液A和B是否避光低温冷藏和使用。 9．配PCR反应液应先加缓冲液再加PCR反应液充分混匀,必要时倒置混匀,再离心,或用灭菌吸头上下吸几次。 10．PCR反应液（包括样品）应充分混匀:保证PCR反应曲线呈S形，全阴性样品呈近似水平曲线。 二．PCR试验操作规程 **血清稀释液：全阴性血清再加2倍HBV DNA提取液混匀, 5000rpm，离心1分钟，混匀血清98℃ 5分钟变性,12000rpm，离心10分钟,吸取上清液。 三.超净工作台的使用、维护保养与清洁标准操作规程 1.目的 建立一个超净工作台的使用、维护保养与清洁标准操作程序，使操作过程标 02 新型冠状病毒核酸检测标准操作程序 1 目的 规范PCR方法检测新型冠状病毒核酸的工作程序，保证实验结果的正确可靠。 2 范围 适合于检验科发热门诊。 3 职责 3.1 检验人员负责按照本检测细则对被检样本进行检测； 3.2 复核人员负责对检测操作是否规范以及检测结果是否准确进行复核； 3.3 专业组负责人负责对专业组综合管理和检测报告的审核。 4 程序、内容和要求 任何新型冠状病毒的检测都必须在具备适当条件的实验室由经过相关技术安全培训的人员进行操作。本程序中的核酸检测方法主要针对新型冠状病毒基因组中开放读码框1a/b （open reading frame 1ab，ORF1ab）和核壳蛋白（nucleocapsid protein，N）。 在实验室要确认一个病例为阳性，满足以下条件：同一份标本中新型冠状病毒2个靶标（ORF1ab、N）特异性PCR检测结果均为阳性。 阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染，需要排除可能产生假阴性的因素，包括：样本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本；样本收集的过早或过晚；没有正确的保存、运输和处理样本；技术本身存在的原因，如病毒变异、PCR抑制等。 4.1 样本采集（推荐鼻/咽拭子） 4.1.1 咽拭子（使用透景样本保存液） 用2 根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入样本保存液（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液）的管中，尾部弃去，旋紧管盖作为样本使用。 4.1.2 鼻拭子（使用透景样本保存液） 将1 根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。上述两根拭子浸入同一甲型乙型流感病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)sop
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