作业指导书-K-B纸片琼脂扩散法药敏试验操作
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照片或图示
操作顺序
检查要点
使用材料
1、试验操作前，提前把单人净化工作台的紫外灯打开，杀菌一个小时；
2、配制MH（A）培养基，121℃高压灭菌15min，取出后在净化工作台中倒入无菌平皿中，每个平皿倒入20ml左右，使培养基厚度约4mm左右；晾干后备用；
3、在净化工作台中进行试验操作，用移液枪取校正好的菌液100μl注入已制备好的MH培养基上，用玻璃涂棒涂抹均匀；
检查要点
使用材料
1）取定性滤纸，用打孔器打成直径为6mm的圆形纸片，放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎，经121℃高压灭菌30min后，放在60℃的烘箱中烘干备用；
2）试验操作前，提前把单人净化工作台的紫外灯打开，杀菌一个小时；药液配制方法参照CLSI抗微生物药物敏感性试验执行标准（2010版）中规定的配制；药液配制在净化工作台中进行；
操作安全
1.高压锅使用时禁止脱水操作、排气未尽时不要打开高压锅；2.所有带菌实验用品，须经有效的消毒灭菌处理后再洗刷。严禁污染下水道。
环境要求
外围：一般பைடு நூலகம்境
无菌操作：万级局部百级洁净
异常处理
1.操作过程中断电，已打开的物品应重新灭菌，以防污染；2.发现污染及时处理；3.操作仪器有异常，及时汇报并报修。
3.纸片在使用前1～2h从冰箱取出，暖至室温再打开，以避免出现冷凝水。纸片启封后应放入可密封的有干燥剂的容器中，纸片只能在有效期内使用，过期应弃去。
1.打孔机、手提式高压蒸汽灭菌锅、恒温干燥箱、电子天平；
2.无菌水、磷酸缓冲盐溶液等溶剂
3.新华定性滤纸
材料处理
1.将材料2及圆纸片放入高压锅，按高压蒸汽灭菌锅操作规程操作，灭菌121℃、30分钟；
制改定
履 历
△1
△3
△5
△2
△4
△6
格式2
作业指导书
主体作业
工序区分：特殊工序
文件编码
批准日期
作业名称
K-B纸片琼脂扩散法药敏试验
工序名称：药敏片制备
起草人
审核人
批准人
执行人
工作概要
药敏片制备
相关文件：
⑴clsi-m100-s20_2010抗菌药物敏感性试验解释标准(中文)⑵wst125-1999纸片法抗菌药物敏感试验标准
照片或图示
操作顺序
1.菌种；2.刻度试管、EP管、枪头、移液枪、平皿
3.肉汤培养基、0.9%无菌氯化钠溶液
4.气浴恒温振荡器、冰箱、手提式高压蒸汽灭菌锅；5.废液缸
材料处理
1.将材料2、3、5放入高压锅，按高压蒸汽灭菌锅操作规程操作，121℃灭菌30分钟；
2.在工作台中放好灭菌过的材料；肉汤及无菌生理盐水冷却至室温后，放入冰箱保存；
3.肉汤培养基、0.9%无菌氯化钠溶液
4.气浴恒温振荡器、冰箱、手提式高压蒸汽灭菌锅；5.废液缸
材料处理
1.将材料2、3、5放入高压锅，按高压蒸汽灭菌锅操作规程操作，121℃灭菌30分钟；
2.在工作台中放好灭菌过的材料；肉汤及无菌生理盐水冷却至室温后，放入冰箱保存；
3.操作完成后，用75%酒精摖拭超净工作台桌面后，开启紫外灯照射30分钟。
3.操作完成后，用75%酒精摖拭超净工作台桌面后，开启紫外灯照射30分钟。
操作安全
1.高压锅使用时禁止脱水操作、排气未尽时不要打开高压锅；2.所有带菌实验用品，须经有效的消毒灭菌处理后再洗刷。严禁污染下水道。
环境要求
外围：一般环境
无菌操作：万级局部百级洁净
异常处理
1.操作过程中断电，已打开的物品应重新灭菌，以防污染；2.发现污染及时处理；3.操作仪器有异常，及时汇报并报修。
2.发现污染及时处理。
3.操作仪器有异常，及时汇报并报修。
制改定
履 历
△1
△3
△5
△2
△4
△6
格式2
作业指导书
主体作业
工序区分：特殊工序
文件编码
批准日期
作业名称
K-B纸片琼脂扩散法药敏试验
工序名称：菌液制备
起草人
审核人
批准人
执行人
工作概要
菌液制备
相关文件：
⑴clsi-m100-s20_2010抗菌药物敏感性试验解释标准(中文)⑵wst125-1999纸片法抗菌药物敏感试验标准
制改定
履 历
△1
△3
△5
△2
△4
△6
格式2
作业指导书
主体作业
工序区分：特殊工序
文件编码
批准日期
作业名称
K-B纸片琼脂扩散法药敏试验
工序名称：药敏试验
起草人
审核人
批准人
执行人
工作概要
检测细菌药物敏感性
相关文件：
⑴clsi-m100-s20_2010抗菌药物敏感性试验解释标准(中文)⑵wst125-1999纸片法抗菌药物敏感试验标准
2.材料2冷却至室温后，放入冰箱保存；圆纸片放入烘箱60℃干燥
3.操作完成后，用75%酒精摖拭超净工作台桌面后，开启紫外灯照射30分钟。
操作安全
1.高压锅使用时禁止脱水操作、排气未尽时不要打开高压锅；
环境要求
外围：一般环境
无菌操作：万级局部百级洁净
异常处理
1.操作过程中断电，已打开的物品应重新灭菌，以防污染。
4、用无菌生理盐水校正菌液浓度，使其相当于0.5麦氏比浊标准（1×108CFU/ml），备用。
1.菌液培养要在35℃培养16～18h
2.菌液的浓度要用无菌生理盐水校正，使其相当于0.5麦氏比浊标准（1×108CFU/ml），如果菌液浓度过稀或过浓，会直接导致药敏试验结果不准确。
1.菌种；2.刻度试管、EP管、枪头、移液枪
3）采用逐片加量法，在超净工作台中进行操作，把灭菌后的圆纸片逐片放入无菌平皿内，每个药敏片加药量为10μl，其含药量参照上述标准。平皿盖上表明药物名称；
4）药敏片干燥后，应保存于干燥环境，在8℃以下冷藏或-14℃以下冷冻保存。
1.药敏片制备时要选用切口整齐，没有毛边的圆片；
2.β-内酰胺类药的纸片应密封冷冻保存，仅取出少量作为日常使用，在冰箱里保存约一周。有些不稳定的抗生素须冷冻保存，用时取出。
3.手持平皿从背面目测检查每块平板，借反射光，用游标卡尺量取抑菌环直径，测量抑菌环直径须包含纸片直径，单位为毫米。
4.肉眼见不到细菌明显生长的区域为抑菌环边缘，有很难辨认的细小菌落者不算；甲氧苄氨嘧啶和磺胺药的拮抗剂会支持细菌生长，因而测这类药时可忽略轻微生长（80%以上受抑制），以浓密生长的区域作为抑菌环的界限
照片或图示
操作顺序
检查要点
使用材料
1、试验操作前把所用的肉汤、0.9%氯化钠溶液、刻度试管、EP管、枪头、废液缸等灭菌后放入净化工作台中，备用
2、试验操作前，提前把单人净化工作台的紫外灯打开，杀菌一个小时；试验操作前，提前半小时把冷冻保存的菌种拿至室温解冻；
3、在净化工作台中进行试验操作，取解冻后的菌种50μl接种至5ml的肉汤培养基中，放入气浴恒温振荡器中，35℃条件下培养16h～18h，取出备用。
4、接种平板后，贴上药敏纸片。贴上纸片15min内，须把平板倒放在35℃恒温培养箱中。
5、测量抑菌环，经16～18h培养后，观察结果。
6、结果判断参照CLSI(2010)抗菌药物敏感性试验解释标准
1.菌液的浓度要合适（1×108CFU/ml）且涂得均匀，抑菌环规则，细菌呈融合生长。
2.贴药敏片时，要用镊子压一下纸片使其与培养基表明贴牢，纸片要贴的均匀，纸片与纸片中心距离不得小于24mm。
操作顺序
检查要点
使用材料
1、试验操作前，提前把单人净化工作台的紫外灯打开，杀菌一个小时；
2、配制MH（A）培养基，121℃高压灭菌15min，取出后在净化工作台中倒入无菌平皿中，每个平皿倒入20ml左右，使培养基厚度约4mm左右；晾干后备用；
3、在净化工作台中进行试验操作，用移液枪取校正好的菌液100μl注入已制备好的MH培养基上，用玻璃涂棒涂抹均匀；
检查要点
使用材料
1）取定性滤纸，用打孔器打成直径为6mm的圆形纸片，放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎，经121℃高压灭菌30min后，放在60℃的烘箱中烘干备用；
2）试验操作前，提前把单人净化工作台的紫外灯打开，杀菌一个小时；药液配制方法参照CLSI抗微生物药物敏感性试验执行标准（2010版）中规定的配制；药液配制在净化工作台中进行；
操作安全
1.高压锅使用时禁止脱水操作、排气未尽时不要打开高压锅；2.所有带菌实验用品，须经有效的消毒灭菌处理后再洗刷。严禁污染下水道。
环境要求
外围：一般பைடு நூலகம்境
无菌操作：万级局部百级洁净
异常处理
1.操作过程中断电，已打开的物品应重新灭菌，以防污染；2.发现污染及时处理；3.操作仪器有异常，及时汇报并报修。
3.纸片在使用前1～2h从冰箱取出，暖至室温再打开，以避免出现冷凝水。纸片启封后应放入可密封的有干燥剂的容器中，纸片只能在有效期内使用，过期应弃去。
1.打孔机、手提式高压蒸汽灭菌锅、恒温干燥箱、电子天平；
2.无菌水、磷酸缓冲盐溶液等溶剂
3.新华定性滤纸
材料处理
1.将材料2及圆纸片放入高压锅，按高压蒸汽灭菌锅操作规程操作，灭菌121℃、30分钟；
制改定
履 历
△1
△3
△5
△2
△4
△6
格式2
作业指导书
主体作业
工序区分：特殊工序
文件编码
批准日期
作业名称
K-B纸片琼脂扩散法药敏试验
工序名称：药敏片制备
起草人
审核人
批准人
执行人
工作概要
药敏片制备
相关文件：
⑴clsi-m100-s20_2010抗菌药物敏感性试验解释标准(中文)⑵wst125-1999纸片法抗菌药物敏感试验标准
照片或图示
操作顺序
1.菌种；2.刻度试管、EP管、枪头、移液枪、平皿
3.肉汤培养基、0.9%无菌氯化钠溶液
4.气浴恒温振荡器、冰箱、手提式高压蒸汽灭菌锅；5.废液缸
材料处理
1.将材料2、3、5放入高压锅，按高压蒸汽灭菌锅操作规程操作，121℃灭菌30分钟；
2.在工作台中放好灭菌过的材料；肉汤及无菌生理盐水冷却至室温后，放入冰箱保存；
3.肉汤培养基、0.9%无菌氯化钠溶液
4.气浴恒温振荡器、冰箱、手提式高压蒸汽灭菌锅；5.废液缸
材料处理
1.将材料2、3、5放入高压锅，按高压蒸汽灭菌锅操作规程操作，121℃灭菌30分钟；
2.在工作台中放好灭菌过的材料；肉汤及无菌生理盐水冷却至室温后，放入冰箱保存；
3.操作完成后，用75%酒精摖拭超净工作台桌面后，开启紫外灯照射30分钟。
3.操作完成后，用75%酒精摖拭超净工作台桌面后，开启紫外灯照射30分钟。
操作安全
1.高压锅使用时禁止脱水操作、排气未尽时不要打开高压锅；2.所有带菌实验用品，须经有效的消毒灭菌处理后再洗刷。严禁污染下水道。
环境要求
外围：一般环境
无菌操作：万级局部百级洁净
异常处理
1.操作过程中断电，已打开的物品应重新灭菌，以防污染；2.发现污染及时处理；3.操作仪器有异常，及时汇报并报修。
2.发现污染及时处理。
3.操作仪器有异常，及时汇报并报修。
制改定
履 历
△1
△3
△5
△2
△4
△6
格式2
作业指导书
主体作业
工序区分：特殊工序
文件编码
批准日期
作业名称
K-B纸片琼脂扩散法药敏试验
工序名称：菌液制备
起草人
审核人
批准人
执行人
工作概要
菌液制备
相关文件：
⑴clsi-m100-s20_2010抗菌药物敏感性试验解释标准(中文)⑵wst125-1999纸片法抗菌药物敏感试验标准
制改定
履 历
△1
△3
△5
△2
△4
△6
格式2
作业指导书
主体作业
工序区分：特殊工序
文件编码
批准日期
作业名称
K-B纸片琼脂扩散法药敏试验
工序名称：药敏试验
起草人
审核人
批准人
执行人
工作概要
检测细菌药物敏感性
相关文件：
⑴clsi-m100-s20_2010抗菌药物敏感性试验解释标准(中文)⑵wst125-1999纸片法抗菌药物敏感试验标准
2.材料2冷却至室温后，放入冰箱保存；圆纸片放入烘箱60℃干燥
3.操作完成后，用75%酒精摖拭超净工作台桌面后，开启紫外灯照射30分钟。
操作安全
1.高压锅使用时禁止脱水操作、排气未尽时不要打开高压锅；
环境要求
外围：一般环境
无菌操作：万级局部百级洁净
异常处理
1.操作过程中断电，已打开的物品应重新灭菌，以防污染。
4、用无菌生理盐水校正菌液浓度，使其相当于0.5麦氏比浊标准（1×108CFU/ml），备用。
1.菌液培养要在35℃培养16～18h
2.菌液的浓度要用无菌生理盐水校正，使其相当于0.5麦氏比浊标准（1×108CFU/ml），如果菌液浓度过稀或过浓，会直接导致药敏试验结果不准确。
1.菌种；2.刻度试管、EP管、枪头、移液枪
3）采用逐片加量法，在超净工作台中进行操作，把灭菌后的圆纸片逐片放入无菌平皿内，每个药敏片加药量为10μl，其含药量参照上述标准。平皿盖上表明药物名称；
4）药敏片干燥后，应保存于干燥环境，在8℃以下冷藏或-14℃以下冷冻保存。
1.药敏片制备时要选用切口整齐，没有毛边的圆片；
2.β-内酰胺类药的纸片应密封冷冻保存，仅取出少量作为日常使用，在冰箱里保存约一周。有些不稳定的抗生素须冷冻保存，用时取出。
3.手持平皿从背面目测检查每块平板，借反射光，用游标卡尺量取抑菌环直径，测量抑菌环直径须包含纸片直径，单位为毫米。
4.肉眼见不到细菌明显生长的区域为抑菌环边缘，有很难辨认的细小菌落者不算；甲氧苄氨嘧啶和磺胺药的拮抗剂会支持细菌生长，因而测这类药时可忽略轻微生长（80%以上受抑制），以浓密生长的区域作为抑菌环的界限
照片或图示
操作顺序
检查要点
使用材料
1、试验操作前把所用的肉汤、0.9%氯化钠溶液、刻度试管、EP管、枪头、废液缸等灭菌后放入净化工作台中，备用
2、试验操作前，提前把单人净化工作台的紫外灯打开，杀菌一个小时；试验操作前，提前半小时把冷冻保存的菌种拿至室温解冻；
3、在净化工作台中进行试验操作，取解冻后的菌种50μl接种至5ml的肉汤培养基中，放入气浴恒温振荡器中，35℃条件下培养16h～18h，取出备用。
4、接种平板后，贴上药敏纸片。贴上纸片15min内，须把平板倒放在35℃恒温培养箱中。
5、测量抑菌环，经16～18h培养后，观察结果。
6、结果判断参照CLSI(2010)抗菌药物敏感性试验解释标准
1.菌液的浓度要合适（1×108CFU/ml）且涂得均匀，抑菌环规则，细菌呈融合生长。
2.贴药敏片时，要用镊子压一下纸片使其与培养基表明贴牢，纸片要贴的均匀，纸片与纸片中心距离不得小于24mm。