微生物大实验 土壤中微生物的分离鉴定

土壤中微生物的分离与研究

一、实验目的

1.学习微生物纯系分离、培养方法。

2.掌握划线分离纯化微生物的方法。

3.掌握微生物生理生化反应的研究方法。

4.了解该菌种的生物学特征。

二、实验原理

土壤是微生物的良好生境，土壤中有多种类群的微生物，它们对自然界物质的转化和循环起着极为重要的作用，对农业生产和环境保护有着不可忽视的影响。根际微生物与植物的关系特别密切，不同的土壤和植物对根际微生物产生显著影响，而不同的根际微生物由于其生理活性和代谢产物的不同，也将对土壤肥力和植物营养产生积极或消极的作用。

土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌数减少。

土壤中微生物以细菌数量最多，为几百万个/克土至几亿个/克土，有各种生理类群，营养类型多属异养型，鉴别染色多为革兰氏阳性。放线菌含量为几万个/克土至几百万个/克土，但其生物量不比细菌低，因为菌丝体积较大。土壤中真菌含量为几千个/克土至几十万个/克土，而其生物量常比细菌的大。

通过土壤微生物的分离与计数及划线纯化，涂布分离长出的单菌落，须经划线纯化，再转斜面培养后保藏备用。涂布分离细菌的平板，温箱培养1d～2d后，然后挑取各单菌落的部分培养物，在预先制备好的平板上划线纯化。根据所得纯种菌，依次进行简单染色，革兰氏染色，芽孢染色，确定菌种的形态特征。然后根据伯杰手册确定菌种的大体范围，有针对性的进行生理生化实验，从而最终确定菌种所在的属。

三、实验材料

1.培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基、固体油脂培养基、固体淀粉培养基、葡萄

糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基。

2.染液和试剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、1%结晶紫水溶液、20%硫酸铜水溶

液、95%乙醇、卢戈氏碘液、甲基红指示剂、乙醚、吲哚试剂等等。

3.仪器和其他用品：无菌平板、接种环、试管、刮刀、载玻片、盖玻片、酒精灯、显微镜、

双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸、接种环、镊子、载玻片夹、试管架、

滤纸、锥形瓶、电炉。

四、实验步骤

1.分离纯化

（1）取样

从生物北楼北侧小田地里选择土壤较肥沃的地方取得土壤，称量10g 放入锥形瓶中，加入90ml 水，静置30min。

（2）稀释

将土壤样品10g加入90ml灭菌水中振荡30min，形成土壤悬浊液，取1ml加入装有9ml 灭菌水试管中振荡形成10-1稀释，依次将土壤样品稀释10-2 10-3、10-4、10-5。

（3）涂布

将0、10-1 10-2 10-3、10-4、10-5的稀释样品分别涂布到已制好的固体培养基平板上，每种涂3个平板。

（4）培养

将平板置于37。C恒温培养三天。

（5）分离

从平板中挑取单个菌落按照下图进行平板划线分离培养，培养1天，共选了6种菌，1个霉菌。

图1.平板分区法

（6）纯化

将划线长出的菌接种于已准备好的固体斜面培养基中，培养1天。

（7）镜检

对平板中的6种菌分别进行美蓝染色、革兰氏染色、芽孢染色，放在显微镜下观察，并记录结果。

（8）保种

将长出菌的斜面放入冰箱中保存。

2.霉菌的鉴定

配置PNA土豆培养基，分离纯化后，进行小室培养，然后在显微镜下进行观察，记录形态。

3.生理生化鉴定

分别配置固体油脂培养基、固体淀粉培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基，进行油脂、淀粉分解鉴定，葡萄糖、乳糖发酵鉴定，以及甲基红、吲哚鉴定。

4.查伯杰手册

根据菌落形态、染色性质及生理生化性质查分离出的菌为哪几种菌。

五、实验结果及分析

菌种1 菌种2 菌种3 菌种4 菌种5 菌种6

菌落描述大小

mm

0.3 1.2 2.1 成片0.2 较大

形态圆形圆形圆形不规则圆形不规则

边缘整齐整齐不整齐不整齐整齐不整齐

表面有隆起有隆起有细小颗

粒状突起

光滑褶皱聚于

一点形成

突起呈白

色

光滑

干湿干干干有粘性干湿

颜色乳黄色乳白色白色略显

透明

白色略显

透明

底部乳白

色

透明略显

青色

芽孢有，椭圆

形，位于菌

体中部，不

有有无无无

膨大

菌体形态短杆状椭球形成

链，纺锤状

球状成链单个球体长杆状短杆状

革兰氏染

色

阳性阴性阴性阳性阳性阴性运动性明显不运动明显不运动明显明显淀粉水解是是是是是否

油脂水解否否是否是否

葡萄糖产酸是是是否是否产气否否否否是否

乳糖产酸否否否否是否产气否否否否是否

甲基红红黄红黄红

属芽孢杆菌

属不确定梭菌属消化球菌

属

根瘤菌属硝化杆菌

属

2.细菌计数

平板编号 1 2 3

稀释倍数10-5

每个平板菌落数28 32 34

1g土壤中菌种平均数 1.41×108

1g土壤中菌种数=每平板菌种数×稀释倍数× 1/取样体积数×9

例如：1g土壤中菌种1的数量=32×105× 1/0.2 ×9 =1.44×108

3.霉菌形态

菌丝顶端形状假根足细胞匍匐菌丝确定类型培养的霉菌有横隔扫帚状无无无青霉

4.照片

（1）革兰氏染色

图1 大肠杆菌（油镜）图2 金黄色葡萄球菌（油镜）