pET载体原核表达鉴定与条件优化
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pET28a-sumo载体原核表达鉴定与条件优化
一、是否表达
从-80℃去除冻存菌，以10ul接种5ml 含Kan+LB培养液的试管中，置摇床中37℃，220rmp复苏12h。再以复苏菌接种到新的试管中，置细菌震荡培养箱37℃培养至OD=0.6（菌液刚开始变浑）加入终浓度至1mMIPTG 37℃诱导过夜，收集菌液。取pet28a-sumo 载体1mM诱导对照，pet28a-sumo未诱导和1mM诱导菌液进行SDS-PAGE鉴定。
如在预期位置出现条带，则进行WB鉴定是否表达。
二、感受态
可以尝试BL21，BL21(DE3)还原型，Rossta对6种稀有密码子优化以及BL21(DE3)ply促可溶表达菌株。
三、IPTG浓度
向试管中加入4ml Kan+培养液，接种20ul测序正确的表达菌。置细菌震荡培养箱37℃培养至OD=0.6（菌液刚开始变浑）。向双份中的其中一份诱导菌和空载体对照菌中加入IPTG至终浓度为0.1,0.25,0.5,0.75和1mM的，37℃诱导过夜。取各梯度进行
SDS-PAGE电泳，取诱导量大的最低稀释度进行下一步诱导。
四、诱导时间
以诱导量大的最低稀释度进行诱导，分别在15℃、30℃及37℃诱导过夜，取样进行SDS-PAGE鉴定。
五、上清or包涵体
取复苏菌100ul加至30ml Kan+LB培养液中培养，以上述条件进行诱导，8000rpml离心15min收集菌体,至冰上以工作6s停9s超声20min,再次以8500rpm离心20min,取上清80ul, 80ulPBS重悬沉淀+20ul 4XSDS-PAGE煮样进行电泳检测。
六、附注操作详细：
取1ml菌液12000rpm离心后3min，用PBS涮洗一次后，取80ulPBS重悬菌体+20ul 4XSDS loadingbuffer煮样10min，12000rpm离心10min取上清上样。
SDS-PAGE电泳：取上层10ul 跑两份SDS-PAGE电泳，80V 20min后换120V继续电泳，直至胶板下沿。取其中一块胶进行考马斯亮蓝染色30-40min。回收染液后加入脱色液，稍微脱色30min，放微波炉加热加速脱色，2min/次。反复几次，直至胶基本脱干净。
WB: 取另一份胶进行转膜，剪取同样大小的0.22um的PVDF膜，放入甲醇侵泡5min。
将剪好的吸水海绵放入1X转膜缓冲液浸湿。按海绵-膜-胶-海绵的顺序放置（视转膜仪而定），赶完气泡后15V转40min。将转好的膜放入配好的5%的脱脂乳37℃2h；再放入1:2000稀释的抗His单克隆抗体孵育过夜，PBST洗4次，5min/次；加入到1:5000稀释好的HRP标记的抗鼠二抗进行室温孵育1h，PBST洗4次，10min/次最后一次用PBS 洗；最后进行ECL显色。