原核蛋白表达纯化条件优化方案

原核蛋白表达纯化条件优化方案
1，收菌每10ml一EP管，弃上清后-40度冻存。

（一）缓冲液PH的确定：
2，处理镍柱：（流速控制在30d/min, 5ml注射器）
1）用3-5ml去离子水洗柱；
2）1ml硫酸镍挂柱；
3）3-5ml去离子水洗去余镍；
3，取出菌体20管，每4管（40ml）为一组，分为5组。

菌体沉淀置于冰浴中解冻，分别用1ml PH6.0,6.5,7.0,7.5,8.0的PBS重悬，分别超声至澄清。

离心15000rpm,10min，弃沉淀。

4，纯化：
4）binding buffer 3ml平衡柱子；
5）上样，保留穿透液；
6）洗脱，使用100（or200 mM）咪唑洗2个柱体积；
7）3-5ml去离子水洗柱，再用另一PH缓冲液重复步骤4）-6）
洗柱：先用去离子水洗3-5个柱体积，用EDTA（50mM）洗去NI 3个柱体积，用去离子水洗3-5个柱体积；用NaOH（1M）洗5个柱体积，用去离子水洗3-5个柱体积，用20%乙醇洗3-5个柱体积，封柱于20%乙醇，4度保存；
5，结果用SDS-PAGE检测（配小孔15%胶），变性/非变性对比。

找到Trimer含量最高的缓冲液PH，并进行后面的优化。

对照/全菌/各PH穿透/各PH样品。

6，该步骤中选定的缓冲PH固化用于以下纯化、透析、ELISA包被、筛选等各个步骤。

（二）咪唑浓度的选择
8，取出新1组，选用上一步骤确定的缓冲液超声；
9，上样后分别使用60/80/100/150/200mM咪唑洗脱，每次2个柱体积，
10，结果用SDS-PAGE检测（配小孔15%胶），变性电泳，选用含量最高的咪唑浓度作为洗脱条件。

顺序：对照/全菌/穿透/各浓度咪唑洗脱样品；
（三）疏水抑制剂的选择
11，选用第一步确定PH值的缓冲液，取12组；
12，分别在体系中加入咪唑（10/20/40/50mM/L）/脲（<4M/L:1/2/4M/L）/吐温（<1%）/甘油(5%,10%,15%)/tritonX-100(0.1%)/不加；
13，重复步骤重复步骤4）-6），使用第二步选定的咪唑浓度洗脱；
14，结果用SDS-PAGE检测（配小孔15%胶），非变性电泳。

找到Trimer含量最高，同时背景最低的方案，并固化为后面的纯化条件。

顺序：对照/全菌/各条件穿透/各条件样品；
（四）依照确定好的条件进行大量纯化
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pH 0.2mol/L NaH2PO4(ml) 0.2mol/L Na2HPO4(ml)
5.7 93.5
6.5
5.8 92.0 8.0
5.9 90.0 10.0
6.0 8
7.7 12.3
6.1 85.0 15.0
6.2 81.5 18.5
6.3 7
7.5 22.5
6.4 73.5 26.5
6.5 68.5 31.5
6.6 62.5 3
7.5
6.7 56.5 43.5
6.8 51.0 49.0
6.9 45.0 55.0
7.0 39.0 61.0
7.1 33.0 67.0
7.2 28.0 72.0
7.3 23.0 67.0
7.4 19.0 81.0
7.5 16.0 84.0
7.6 13.0 87.0
7.7 10.5 89.5
7.8 8.5 91.5
7.9 7.0 93.0
8.0 5.3 94.7
Na2HPO4•2H2O分子量= 178.05，0.2 mol/L溶液为85.61克/升。

Na2HPO4•2H2O分子量= 358.22，0.2 mol/L溶液为71.64克/升。

Na2HPO4•2H2O分子量= 156.03，0.2 mol/L溶液为31.21克/升。

来源出处：武汉戴安生物技术有限公司。