线粒体蛋白提取

线粒体蛋白提取

1.线粒体蛋白抽取液配方(pH7.4)：250mM蔗糖，20mM HEPES，10mM KCl,1.5mM MgCl2,1mM EDTA,1mM EGTA,1mM DTT, 17ug/mL PMSF, 8ug/mL aprotinin, 2ug/mL leupeptin；-20℃保存。

2.步骤：

（1）收集5X10E7细胞，并用PBS洗细胞；

（2）往细胞沉淀加入2mL上述抽取液，并混匀，可以采用超声或匀浆器方法破膜，程度至苔盼兰染色约90%的细胞为蓝色。

（3）750g，4℃离心5分钟，收集上清，此时沉淀即为细胞膜成分。

（4）13000rpm,4℃离心30分钟, 弃上清，此时沉淀即为线粒体成分。

（5）用100uL列解液重悬沉淀，-80℃保存备用.

培养悬浮细胞全蛋白裂解的方法

1.细胞裂解液（pH8.0）的配方：20mM Tris-Cl，1% NP-40, 137mM NaCl, 20mM DTT,

2mM Sodium Vanadate，1ug/mL Aprotinin, 1ug/mL leupetin, 1mM PMSF；配好后分装-20℃保存，其中PMSF和蛋白酶抑制剂量使用时现加。

2.裂解方法：按1X106细胞/100uL的比例加细胞裂解液,混匀后冰浴30分钟, 12,000r

pm, 4℃,离心10min, 实验时取25uL的上清加5uL 6X上样缓冲液煮沸5分钟使蛋白变性后，12000rpm离心5分钟，取上清和预染Marker加样电泳。或-80℃保存备用。

细胞核蛋白质的提取2009-04-28 21:28

一、试剂准备

缓冲液A 缓冲液B

10mmol/L HEPES-KOH pH7.9 20mmol/L HEPES-KOH pH7.9

1.5mmol/L MgCL2 1.5mmol/L MgCL2

10mmol/L KCL 420mmol/L NaCL

0.5mmol/L DTT 0.2mmol/L EDTA

0.2mmol/L PMSF 25% Glycerol

0.5mmol/L DTT

0.2mmol/L PMSF

二、操作步骤

1．去细胞培养液，用PBS（含0.05mmol/LPMSF）洗两次，用刮板将细胞刮下，计数细胞，收集于适当体积离心管，用少量PBS冲洗平皿一并吸入离心管。

2．4C离心5分钟，使细胞沉淀。

3．弃上清，将沉淀的细胞用含PMSF的PBS悬起再离心，重复两次。洗去全部细胞培养液及血清成分。

4．取5×105-7细胞，4C离心，弃上清。

5．加入400μl冷缓冲液A，手指弹管壁使沉淀悬起，冰浴10分钟，震荡10秒钟，混匀。

6．离心10秒钟，弃上清，加20~100μl冷缓冲液B使沉淀悬起，冰浴20分钟。

7．4C离心2分钟，弃沉淀。

8．上清为核提取物，分装后-70C保存。（次法每1×106细胞可得到50~75μg核蛋白质）。