DNA体外合成与序列测定
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
DNA的体外合成
A. DNA的化学合成
DNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和 引物，有时也用于人工合成基因和反义寡核苷 酸。目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的， 大多数DNA合成仪是以固相磷酰亚胺法为基础 设 计制造的。
2021/3/4
1
DNA体外合成与序列测定
1. 合成的原理
核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链 的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载 体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序 逐一接长。
每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作， 由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所 以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗 涤的方法除去。
合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割 下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终 产物。
DNA体外合成与序列测定
A. DNA的化学合成
1. 合成的原理
2021/3/4
7
DNA体外合成与序列测定
2021/3/4
8wk.baidu.com
南京D农NA业体大外学合成生与命序科列学测学定院
核酸序列测定
DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是核 苷酸排列方式。RNA测序则通常将RNA提取后，反转录 为DNA后使用DNA测序的方法进行测序。
在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和 改造目的基因的基础。
返回
DNA体外合成与序列测定
Sanger双脱氧链终止法原理
利用DNA聚合酶的两种酶 催反应特性：1、利用单链 DNA模板，合成DNA互补 链；2、利用2’，3’双脱 氧核苷三磷酸作底物，参 入到寡核酸链的末端，从 而终止DNA链的生长。有 时也称引物合成法，或酶 催引物合成法。
核酸固相磷酰亚胺 法合成时，末端核苷酸 的 3′-OH 与 固 相 载 体 成 共价键，5′-OH被4，4′二甲氧基三苯甲基 (DMTr)保护，下一个核 苷 酸 的 5′-OH 亦 被 DMTr 保 护 ， 3′-OH 上 的 磷 酸 基 上 有 -N(C3H7)2 和 OCH3两个基团。
2021/3/4
60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研 究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实。第一，如何分离寡 核苷酸片段；另一方面，在研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束 缚。1965，Cornall大学以S．W．Holle，为首的科学家小组，首次完成 7 5 个 核 苷 酸 的 酵 母 丙 氨 酸 tRNA 的 全 序 列 测 定 。 即 利 用 各 种 RNA 酶 把 tRNA降解成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。
2021/3/4
5
DNA体外合成与序列测定
第二节 DNA的体外合成
B. 聚合酶链式反应（PCR） 聚合酶链式反应是上世纪80年代发展起来的一种体外快
速 扩 增 特 异 DNA 序 列 的 技 术 。 此 技 术 于 1985 年 由 Mullis发明，1988年耐热TaqDNA聚合酶的发现令该技 术使用更加方便、有效。 PCR可以说是20世纪核酸分子生物学研究领域的最重大 发明之一，这不仅表现在该方法本身的简单和巧妙，而 且还表现在它的出现高速发展了大量在以前看来似乎不 可能的生物学技术。 Mullis因其卓越的贡献而获1993年的诺贝尔化学奖。
纯化：纯化的目的主要是去掉短的寡核苷酸片段，盐及各种保护基等杂质。 通常采用的纯化方法有电泳法、高效液相色谱法和高效薄层色谱法等。纯 化这一步操作是可以选择的，对要求不高的应用如PCR等可不纯化。
近年来发展了一些修饰试剂，可在合成寡核苷酸时，对某些核苷酸进 行一定的修饰，为寡核苷酸探针的非放射性标记提供了新途径。
目前应用最广泛的是：
Sanger双脱氧链终止法。
Maxam-Gilbert DNA化学降解法。
新技术：杂交测序法， 质谱法， 单分子测序法， 原子探 针显微镜测序法，DNA 芯片法 。
2021/3/4
9
南京D农NA业体大外学合成生与命序科列学测学定院
Sanger双脱氧链终止法
DNA核酸序列分析历程
变性。加热模板使其解离成单链。
退火。降低温度使人工合成的寡核苷酸引物与模板 DNA 中所要 扩增的靶序列的两侧按碱基配对原则相结合。
延伸。在适宜条件下，TaqDNA聚合酶利用dNTP使引物3′端向前 延伸，合成与模板碱基完全互补的DNA链。这样变性、退火和 延伸构成一个循环，每一次循环的产物可作为下一次循环的模板， 经过30～35个循环后，界于两个引物之间的靶序列得到大量复制， 拷贝数约增加106～107倍。
3
DNA体外合成与序列测定
每延伸一个核苷酸需四步化学反应：
(1) 脱三苯甲基：末 端核苷酸的DMTr用 三氯乙酸/二氯甲烷 溶液脱去，游离出 5′-OH 。
(2) 缩合：新生成的5′-OH 在 四唑催化下与下一个核苷3′-磷 酰亚胺单体缩合使链增长。
2021/3/4
(3) 盖帽：有少量(小于0.5%)未缩合的5′-OH 要在 甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化 封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。
(4) 氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成
五价磷。
上述步骤循环一次，核苷酸链向5′方向延伸一个核苷酸。
4
南京D农NA业体大外学合成生与命序科列学测学定院
A. DNA的化学合成
2. 合成后处理
合成后的寡核苷酸链仍结合在固相载体上，且各种活泼基团也被保 护基封闭着，要经过以下合成后处理才能最后应用。
切割：合成的寡核苷酸链仍共价结合于固相载体上，用浓氨水可将其切割 下来。切割后的寡核苷酸具有游离的3′-OH。
脱保护：切割后的寡核苷酸磷酸基及碱基上仍有一些保护基，这些保护基 也必须完全脱去。磷酸基的保护基β-氰乙基在切割的同时即可脱掉，而碱 基上的保护基苯甲酰基和异丁酰基则要在浓氨水中55℃放置15h左右方能脱 掉。
2021/3/4
6
南京D农NA业体大外学合成生与命序科列学测学定院
B. 聚合酶链式反应（PCR）
PCR的原理：
原理类似于DNA的天然复制过程。即在模板DNA、寡核苷 酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）底物和Mg2+存在 的条件下，由耐热的TaqDNA聚合酶催化DNA的复制，合 成靶DNA。PCR包括三个基本过程：
A. DNA的化学合成
DNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和 引物，有时也用于人工合成基因和反义寡核苷 酸。目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的， 大多数DNA合成仪是以固相磷酰亚胺法为基础 设 计制造的。
2021/3/4
1
DNA体外合成与序列测定
1. 合成的原理
核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链 的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载 体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序 逐一接长。
每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作， 由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所 以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗 涤的方法除去。
合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割 下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终 产物。
DNA体外合成与序列测定
A. DNA的化学合成
1. 合成的原理
2021/3/4
7
DNA体外合成与序列测定
2021/3/4
8wk.baidu.com
南京D农NA业体大外学合成生与命序科列学测学定院
核酸序列测定
DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是核 苷酸排列方式。RNA测序则通常将RNA提取后，反转录 为DNA后使用DNA测序的方法进行测序。
在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和 改造目的基因的基础。
返回
DNA体外合成与序列测定
Sanger双脱氧链终止法原理
利用DNA聚合酶的两种酶 催反应特性：1、利用单链 DNA模板，合成DNA互补 链；2、利用2’，3’双脱 氧核苷三磷酸作底物，参 入到寡核酸链的末端，从 而终止DNA链的生长。有 时也称引物合成法，或酶 催引物合成法。
核酸固相磷酰亚胺 法合成时，末端核苷酸 的 3′-OH 与 固 相 载 体 成 共价键，5′-OH被4，4′二甲氧基三苯甲基 (DMTr)保护，下一个核 苷 酸 的 5′-OH 亦 被 DMTr 保 护 ， 3′-OH 上 的 磷 酸 基 上 有 -N(C3H7)2 和 OCH3两个基团。
2021/3/4
60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研 究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实。第一，如何分离寡 核苷酸片段；另一方面，在研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束 缚。1965，Cornall大学以S．W．Holle，为首的科学家小组，首次完成 7 5 个 核 苷 酸 的 酵 母 丙 氨 酸 tRNA 的 全 序 列 测 定 。 即 利 用 各 种 RNA 酶 把 tRNA降解成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。
2021/3/4
5
DNA体外合成与序列测定
第二节 DNA的体外合成
B. 聚合酶链式反应（PCR） 聚合酶链式反应是上世纪80年代发展起来的一种体外快
速 扩 增 特 异 DNA 序 列 的 技 术 。 此 技 术 于 1985 年 由 Mullis发明，1988年耐热TaqDNA聚合酶的发现令该技 术使用更加方便、有效。 PCR可以说是20世纪核酸分子生物学研究领域的最重大 发明之一，这不仅表现在该方法本身的简单和巧妙，而 且还表现在它的出现高速发展了大量在以前看来似乎不 可能的生物学技术。 Mullis因其卓越的贡献而获1993年的诺贝尔化学奖。
纯化：纯化的目的主要是去掉短的寡核苷酸片段，盐及各种保护基等杂质。 通常采用的纯化方法有电泳法、高效液相色谱法和高效薄层色谱法等。纯 化这一步操作是可以选择的，对要求不高的应用如PCR等可不纯化。
近年来发展了一些修饰试剂，可在合成寡核苷酸时，对某些核苷酸进 行一定的修饰，为寡核苷酸探针的非放射性标记提供了新途径。
目前应用最广泛的是：
Sanger双脱氧链终止法。
Maxam-Gilbert DNA化学降解法。
新技术：杂交测序法， 质谱法， 单分子测序法， 原子探 针显微镜测序法，DNA 芯片法 。
2021/3/4
9
南京D农NA业体大外学合成生与命序科列学测学定院
Sanger双脱氧链终止法
DNA核酸序列分析历程
变性。加热模板使其解离成单链。
退火。降低温度使人工合成的寡核苷酸引物与模板 DNA 中所要 扩增的靶序列的两侧按碱基配对原则相结合。
延伸。在适宜条件下，TaqDNA聚合酶利用dNTP使引物3′端向前 延伸，合成与模板碱基完全互补的DNA链。这样变性、退火和 延伸构成一个循环，每一次循环的产物可作为下一次循环的模板， 经过30～35个循环后，界于两个引物之间的靶序列得到大量复制， 拷贝数约增加106～107倍。
3
DNA体外合成与序列测定
每延伸一个核苷酸需四步化学反应：
(1) 脱三苯甲基：末 端核苷酸的DMTr用 三氯乙酸/二氯甲烷 溶液脱去，游离出 5′-OH 。
(2) 缩合：新生成的5′-OH 在 四唑催化下与下一个核苷3′-磷 酰亚胺单体缩合使链增长。
2021/3/4
(3) 盖帽：有少量(小于0.5%)未缩合的5′-OH 要在 甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化 封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。
(4) 氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成
五价磷。
上述步骤循环一次，核苷酸链向5′方向延伸一个核苷酸。
4
南京D农NA业体大外学合成生与命序科列学测学定院
A. DNA的化学合成
2. 合成后处理
合成后的寡核苷酸链仍结合在固相载体上，且各种活泼基团也被保 护基封闭着，要经过以下合成后处理才能最后应用。
切割：合成的寡核苷酸链仍共价结合于固相载体上，用浓氨水可将其切割 下来。切割后的寡核苷酸具有游离的3′-OH。
脱保护：切割后的寡核苷酸磷酸基及碱基上仍有一些保护基，这些保护基 也必须完全脱去。磷酸基的保护基β-氰乙基在切割的同时即可脱掉，而碱 基上的保护基苯甲酰基和异丁酰基则要在浓氨水中55℃放置15h左右方能脱 掉。
2021/3/4
6
南京D农NA业体大外学合成生与命序科列学测学定院
B. 聚合酶链式反应（PCR）
PCR的原理：
原理类似于DNA的天然复制过程。即在模板DNA、寡核苷 酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）底物和Mg2+存在 的条件下，由耐热的TaqDNA聚合酶催化DNA的复制，合 成靶DNA。PCR包括三个基本过程：