棉花DNA提取方法

棉花DNA提取方法

DNA提取采用CTAB法（Paterson et al.，1993），并稍加修改，具体步骤如下：

（1）将1g冻叶（或鲜叶）放入预冷的研钵中，加入液氮研磨。分2次加入5ml新鲜配制的提取缓冲液（表3-2），转入10ml的离心管中，涡旋混匀，冰浴保存10min。10000rpm离心20min（4℃），弃上清;

（2）于沉淀中加入3ml 65℃预热的裂解缓冲液（表3-3），并用铜丝搅松，涡旋混匀，65℃水浴30min；

（3）加入3ml氯仿∶异戊醇（24：1）混合液，翻转50次以上，10000rpm离心20min（15℃），将上清转入10 ml的离心管中，加0.6体积的预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10min，10000rpm，离心10min（RT），弃上清，于沉淀中加入2 ml 70%的乙醇洗涤，并转入5 ml的离心管中，10000rpm离心5min。倒掉上清液，通风干燥20min；

（4）加2 ml TE缓冲液溶解，65℃培养10~30min，加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，缓慢翻转50次，混匀，室温静置5min，10000rpm离心10min；

（5）上清液转入5ml离心管中，加0.1体积的3M醋酸钠(pH 5.2)，加等体积的异丙醇后翻转30次，放置30min，10000rpm离心5min。弃上清液，加1 ml 70%乙醇洗DNA小团，转入1.5 ml的离心管中，10000rpm离心5min。弃上清液，自然通风干燥DNA小团；

（6）加200 l TE缓冲液（10mM Tris/HCl(PH 8.0)，1mM EDTA(PH 8.0)，PH 8.0）溶解DNA（4℃，30min以上），并保存。

表3-2 DNA提取缓冲液配制

Table 3-2 Extration solutions to extract DNA

工作液Working Solution ml ml 存储液Stock Solution

0.35M Glucose 34.68g 6.936g Glucose

0.1M Tris.HCl 50 10.0 1.0M Tris.HCl(pH 8.0)

5mM Na.EDTA 5 1.0 0.5M EDTA(pH 8.0) 2% PVP 100 20.0 10% PVP 1%(V/V)β-Me 5 1.0 Liquid dd Water 340 68.0

Total 500ml 100ml

表3-3 裂解缓冲液配制

Table 3-3 Lysis solutions to extract DNA

工作液Working Solution ml Ml 存储液Stock Solution

1.4M NaCl 40.908g 8.1816g Salt

0.1M Tris.HCl 50 10 1.0M Tris.HCl(pH 8.0)

20mM Na.EDTA 20 4 0.5M Na.EDTA(pH 8.0) 2%CTAB 100 20 10% CTAB

2% PVP 100 20 10% PVP 1%(V/V)β-Me 5 1.0 Liquid dd Water 225 45

Total 500ml 100ml