第十一章 微生物的基本研究方法

注意：

微生物经过染色以后，就已经被杀死。 用涂片染色法制作成的微生物标本片可直接 观察，不用加盖玻片，可根据微生物的大小 分别采用低倍镜、高倍镜及油镜。
第一节 微生物的观察
（二）、微生物活体观察 微生物活体观察法有两种，压滴法和悬滴法，常用 方法为压滴法 *1、压滴法 做法：取一小滴菌液或活性污泥液等，放在洁净的 载玻片中央，用盖玻片覆盖后，即可以进行观察。 水处理过程中活性污泥生物相的观察等常用此法。
11-4 液体培养基示意图
第二节 微生物的培养和纯种分离
固体培养基：可以制成平板和斜面培养基。 平板固体培养：分离菌种、计数等。 斜面固体培养：保藏菌种。 （一）、固体培养基 1、制成形式 制成形式见图11-5和图11-6。

第二节 微生物的培养和纯种分离
图11-5
第二节 微生物的培养和纯种分离
第一节 微生物的观察 ⑥、吸干 将载玻片倾斜，用吸水纸吸去涂片边缘 的水珠（注意勿将细菌擦掉）。 ⑦、镜检 待标本片干后置显微镜下，先用低倍镜 观察，发现目的物后再用油镜观察。
第一节 微生物的观察
（2）、细菌的复染色法（鉴别染色法） 细菌复染色法用两种染料使细菌着色，有鉴别作 用，所以又称为鉴别染色法。如革兰氏染色法是 常见的细菌复染色法，可以鉴别革兰氏阳性细菌 和革兰氏阴性细菌。 革兰氏染色法具体步骤及方法： ①涂片 ②干燥 ③固定（此三步同细菌的单染色）
第一节 微生物的观察
电子显微镜观察的物体必须在真空和干燥的状 态下进行，因而无法用来进行活体的观察。 因此，微生物的观察最常用的是光学显微镜 （常简称显微镜）。 二、观察方法 *观察方法分为涂片染色观察法、活体观察法 （压滴法）。 （一）、涂片染色观察法（微生物死体的观察）

第一节 微生物的观察

如果我们得不到合适的样品，可以从一 般土壤里去寻找，土壤是微生物的大本 营，一克土壤中含有几十万到若干亿微 生物，各种微生物应有尽有。许多微生 物的分离筛选工作常从收集土壤样品开 始。
第二节 微生物的培养和纯种分离
2、直接分离或增值培养 收集的样品有两种情况： 直接分离：样品中含有所需要的微生物较多，可 直接用合适的固体培养基进行纯种分离； 增值培养：样品中所含需要的微生物较少，在分 离之前需要用液体培养基进行增殖培养处理，使 需要的微生物大量生长起来，而不需要的微生物 不发展或发展很少，以利筛选分离。


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图11-10 菌种分离的主要步骤
第二节 微生物的培养和纯种分离 *（四）、不同微生物培养条件的选择 1、控制温度 培养不同的微生物所需要的温度不一样。 一般的微生物最适宜的温度在20~40℃之 间选择，耐高温微生物在温度为50~60 ℃。 因此，培养不同微生物时可详细查阅其 培养温度和时间，以便得到最佳培养。 例如：
第二节 微生物的培养和纯种分离

例如：在分离分解氰化物的微生物时， 如果样品中这类微生物不多，就应把样 品加到含有氰化物的液体培养基中，使 它们经过一段时间的培养后，再进行分 离。通过这样的培养，也可以使不适于 在有氰化物环境中生长的微生物不发展 或少发展。
第二节 微生物的培养和纯种分离
3、稀释培养液 将样品或经增殖培养后的样品中的微生物用灭菌 过的水进行稀释。 4、菌种分离 分离用培养皿进行,分离方法分为稀释平板法和平 板划线法两种。 （1）、稀释平板法（如果样品中的微生物不多， 可以不作稀释，视具体情况确定）
图11-1
第一节 微生物的观察
②、干燥 最好在空气中自然风干，为了加快干燥速度，可 在微小火焰上方烘干。但不宜在高温下长时间烤 干，否则急速失水会使菌体变形。（正面向上） ③、固定 将已干燥的涂片正面向上，玻片于酒精灯的火焰 中通过 3~4 次，以玻片与手接触面感到稍微烫手 为度。 作用：一是使菌体固定于玻片上不易脱落，二是 可使标本容易着色。
第二节 微生物的培养和纯种分离 1、寻找 在进行纯种分离以前，先要寻找生活着我 们所需要的微生物 (菌种)的样品。 例如：筛选分解氰化物能力强的菌种，可 以从有含氰废水排出的工厂附近的水沟、 土壤中或含氰废水生物处理的污泥杂质里 去寻找，因为在这些东西里能分解氰化物 的微生物比别处多。
第二节 微生物的培养和纯种分离
第一节 微生物的观察 染色的方法主要有：单染色法、复染色法两 种。而用于细菌的芽孢、荚膜、鞭毛等的复 杂染色法则不常用。 *（1）、细菌单染色法 单染色法只用一种染料使细菌着色,主要是 帮助观察细菌的形状和大小，鉴别作用不大。 常用染色液为美蓝、石炭酸品红等。 步骤及方法：P341

第一节 微生物的观察
第二节 微生物的培养和纯种分离

做法： 将样品或经增殖培养后的样品中的微生物用灭 菌过的水进行稀释后倒入培养皿，然后再倒入 融化的固体培养基溶液，摇动均匀，使菌体分 散在培养基内。培养基冷凝成平板时分散的菌 体就被固定，经一定时间的培养后，这种被固 定的单个菌体便繁殖形成一个个能被肉眼看到 的菌落。这种由单个菌体发展成的菌落就是我 们所需要的纯种。这种分离微生物的方法称为 稀释平板法。见下图。
第十一章 微生物的基本研究方法
微生物的基本研究主要是在实验室中进行 的，主要有微生物的观察、微生物的培养 和纯种分离、微生物基本研究过程中的灭 菌与无菌操作。 主要教学内容： 第一节 微生物的观察 第二节 微生物的培养和纯种分离 第三节 灭菌与无菌操作

第一节

微生物的观察
教学目的要求： 掌握： 1、观察微生物所常用的光学显微镜分类、应用。 2、微生物单染色后的观察方法与活体的观察方法。 3、细菌的染色法及其应用，细菌单染色的原理、步 骤。 4、从试管中采取菌体制备染色涂片的无菌操作过程。
第二节 微生物的培养和纯种分离
二、微生物纯种的分离 （筛选对于某种特定废水或污染物具有强大氧化分 解能力的菌种） 近年来，为了要提高特定废水生物处理的处理效 率，国内外都在进行分离和培养纯菌种处理此特 定废水的试验研究。 近年来，用微生物浸矿也需要分离和培养纯的优 良菌种。微生物浸矿也称为微生物选冶。 *（一）、微生物纯种分离的主要步骤
第二节 微生物的培养和纯种分离

采用固体培养基时，可把培养基装在培养皿内， 凝成较大的平面，制成平板；或把培养基装在 试管中，凝成斜面。
图11-11
图11-12
第二节 微生物的培养和纯种分离



①涂片 取干净的载玻片于实验台上，在正面的中央滴一 小滴无菌水或生理盐，将接种环在火焰上烧红， 待冷却后从斜面挑取少量待染色的菌种与玻片的 水滴混匀，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂 布面不宜过大。 活性污泥染色可用小液管取一滴活性污泥液于载 玻片上铺成一薄层即可。 *下图为做涂片的无菌操作过程。
第一节 微生物的观察
图11-3 压滴法 1-载玻片；2-盖玻片
第二节 微生物的培养和纯种分离 教学目的要求： 掌握： 1、微生物纯种分离的主要步骤。 2、培养不同微生物时培养条件的选择。 3、利用纯菌种处理废水目前存在的问题。

第二节 微生物的培养和纯种分离
一、微生物的培养及培养基（复习，见第二章） 环境工程中，根据培养微生物常用培养基的物理状 态分为：液体培养基和固体培养基两种。 液体培养基：用于细菌或微生物的增殖培养等。
第一节 微生物的观察
④初染 加草酸铵结晶紫一滴染色约 lmin，水洗。 ⑤、媒染 加碘液覆盖约lmin，水洗。 作用：进入菌体细胞内与结晶紫形成复合物， 帮助染料与菌体蛋白结合。 ⑥、脱色（关键步骤）
第一节 微生物的观察 斜置载玻片于一烧杯之上，滴加95%乙醇 脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，随 即水洗。（注：为了节约乙醇，可将乙 醇滴在涂片上静置0.5~1min，水洗） ⑦、复染 用砂黄染液复染0.5min，水洗。 ⑧、吸干 用吸水纸吸掉水滴。（切勿擦拭）
第一节
微生物的观察
一、观察微生物的常用设备 显微镜分为普通光学显微镜、电子显微镜 等等，观察微生物的常用设备为普通光学 显微镜。 *（一）、普通光学显微镜分类、应用 普通光学显微镜的分类： 低倍镜（放大倍数100左右） 应用：活性污泥菌胶团及生物相的观察等。
第一节

微生物的观察
高倍镜（放大倍数400左右） 应用：霉菌、酵母菌等的观察、用血球计数板观 察细菌等。 油镜（放大倍数1000左右） 细菌的观察等。 光学显微镜可用于观察微生物活体和死体。 （二）、电子显微镜 电子显微镜在微生物的研究中主要用于病毒及细 菌微细结构的观察，如鞭毛等的观察。
第二节 微生物的培养和纯种分离
图11-7
稀释平板法
第二节 微生物的培养和纯种分离
（2）、平板划线法（微生物不多，可以不作稀 释） 做法：用接种环蘸取样品稀释液，在平板培养 基上轻轻的按顺序划线，见图11-8。这种在平 板上划线的方法称为平板划线法。
图11-8
第二节 微生物的培养和纯种分离

木棒（或橡皮管）
图11-6
第二节 微生物的培养和纯种分离
2、作用 （1）、平板培养基适用于分离菌种和菌种计数。 原因是平板表面积大，容易分离得到纯菌种。 （2）、斜面培养基适易于培养和保藏菌种。 原因是斜面底部可保存一些冷凝水，微生物不 容易死亡；斜面做在试管内，表面积较小，不 容易受到污染。
第二节 微生物的培养和纯种分离



好氧的异养细菌：37℃恒温，24~48h。 厌氧菌的丙酮丁酸梭菌、产气荚膜梭菌： 37℃，7d。 酵母菌：28℃，2~3d。 霉菌、放线菌：28℃，5~7d。
第二节 微生物的培养和纯种分离
2、控制空气 培养好氧微生物 采用液体培养基时，培养容器内所装液体培养基 的深度应当浅些，可以让空气比较容易透入下部。 如有条件，还可采用一种能够振荡的摇床，把装 有液体培养基和菌种的培养瓶固定在摇床上，利 用电动机的带动，不停地振荡，使瓶内的培养基 和菌种不断搅拌，充分接触空气。
平板划线的几种典型方法：
图11-9
平板划线的典型方法
第二节 微生物的培养和纯种分离
微生物随着划线次数的增加而分散。一定时间的培 养后在画线的最后部分可形成单个分散的菌落，获 得纯菌种。 5、斜面纯种增殖培养 将分离开的单个菌落接种到斜面培养基上进行增殖 培养。 6、性能测定

第二节 微生物的培养和纯种分离 将用平板分离开的所有菌种用斜面固体培 养基增殖培养后进行性能等方面的测定， 以获得目标菌种（纯菌种）。 如氧化分解特定污染物的能力如何等，从 而筛选出目标菌种。 菌种分离的主要步骤见下图，在操作中所 用的器皿，培养基等在使用前均需要灭菌。


细菌等微生物很小，而且都是无色半透明的，用普 通显微镜放大，也只能粗略地看到其大小和形态。 象鞭毛、荚膜等特殊结构更是看不清楚。因此要想 观察清楚，就必须进行染色。 染色常用染料有美蓝、结晶紫、沙黄等碱性染料。 染色原理：细菌细胞内含有大量的蛋白质，其等电 点较低，约在pH2~5之间，所以在中性、碱性或弱 酸性溶液中细菌都是带负电的，碱性染料电离时染 料离子带正电，容易与带负电的细菌相结合而使细 菌着色。
第一节 微生物的观察
④、染色 在载玻片上滴加染色液（石炭酸品红或美蓝等）， 使染液铺盖涂有细菌的部位并持续一定的时间 （石炭酸品红约1~2min，美蓝约3~5min，结晶紫 1min ）。 ⑤、水洗 染色到达所需时间后，倾去染色液，将玻片稍倾 斜，用细水流将涂片上的剩余染料洗去，直至水 呈无色为止。水流切勿过急过猛，水由玻片上端 流下，避免直接冲在涂片处。

第一节 微生物的观察
⑨、镜检 待标本片干后置显微镜下，先用低倍镜观察，发 现目的物后再用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。 革兰氏染色法的染色反应特征：
阳性菌 图11-2
阴性菌 革兰氏染色法的染色反应特征
第一节 微生物的观察 （3）、复杂染色法 用于细菌的芽孢、荚膜、鞭毛等的观察。这 部分在此不做介绍，详细可参阅微生物专书。