核酸提取和注意事项 ppt

➢ 破壁或裂解不充分
——充分研磨、破壁酶、延长裂解时间
➢ 沉淀不完全
——低温、延长沉淀时间
➢ 洗涤使得丢失DNA
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一．核酸简介 二．基因组DNA提取 三．质粒DNA提取 四．真核细胞总RNA提取 五．琼脂糖凝胶电泳
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质粒DNA提取
质粒DNA提取的方法： ➢碱裂解法 ➢煮沸法
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质粒DNA提取——碱裂解法原理
基因组DNA提取——CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
➢ CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide， 十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂， 可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7 mol/L NaCl）是可 溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚 类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
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离心柱型质粒DNA提取试剂盒工作原理
离心柱型质粒DNA提取试剂盒采用改进的 SDS-碱裂 解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液 将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐、高pH值的洗 脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
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基因组DNA提取——CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方
组份 终浓度
Tris-HCl （pH 8.0）
100 mM
EDTA （pH 8.0）
NaCl
20 mM
0.4 M
CTAB
β-巯基乙醇
2% (W/V)
0.1%（V/V） 使用前加入
Tris-HCl （pH 8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，
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基因组DNA提取——CTAB法
CTAB法实验流程
植物材料
抽提
离心洗涤
液氮研磨
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
核酸沉淀
Biblioteka Baidu
DNA溶液
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基因组DNA提取——SDS法
SDS法原理
➢ SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能 裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
➢ 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白 质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；
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质粒DNA提取及检测——实验准备
1.实验器材
台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、 marker笔、 电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。
2.实验耗材
无菌2 mL/1.5 mL EP管、各规格Tip、一次性手套等。
3.实验试剂
质粒小提试剂盒（离心柱型，YRBIO) 、LB培养基、抗生素、 琼脂糖、DNA Loading Buffer、 GoldView核酸染料、 TAE电泳缓冲液等。
学习汇报
核酸提取的原理及方法
汇报人:富贵 青海大学2010级研究生
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前言
• 核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象， 因此，核酸的提取是分子生物学实验技术 中最重要、最基本的操作。
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一．核酸简介 二．基因组DNA提取 三．质粒DNA提取 四．真核细胞总RNA提取 五．琼脂糖凝胶电泳
➢ DNA中残留有金属离子 ——重新70%乙醇漂洗
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基因组DNA提取常见问题分析
DNA降解
– 材料不新鲜或反复冻融 – 未很好抑制内源核酸酶的活性 – 提取过程操作过于剧烈，DNA被机
械打断 – 外源核酸酶污染
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基因组DNA提取常见问题分析
DNA提取量少
➢ 实验材料不佳或量少
—— 选取新鲜（幼嫩）材料
使酚容易去除。
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基因组DNA提取——CTAB法
• CTAB提取缓冲液的改进配方
组份 终浓度
Tris-HCl （pH 8.0）
EDTA （pH 8.0）
NaCl
CTAB
PVP40 β-巯基乙醇
100 mM
20 mM
0.4 M
3% (W/V)
5% (W/V)
2%（V/V） 使用前加入
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种 不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同 时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
质粒主要发现于细菌、 放线菌和真菌等细胞中， 它具有自主复制和转录能 力，能在子代细胞中保持 恒定的拷贝数，并表达所 携带的遗传信息。
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一．核酸简介 二．基因组DNA提取 三．质粒DNA提取 四．真核细胞总RNA提取
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基因组DNA提取的几种常用方法： CTAB法 SDS法 其他方法
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小鼠gDNA电泳图
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基因组DNA提取常见问题
DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR 反应
DNA降解
DNA量少
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基因组DNA提取常见问题分析
DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应
➢ DNA中含有蛋白、多糖、多酚类物质 ——抽提纯化、高盐洗涤
➢ DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 ——重新沉淀
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核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3′，5′- 磷酸 二酯键连接而成的一类生物大分子。包括核糖核 酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两类。
DNA主要储存遗传信息。 RNA主要传递遗传信息。
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如何分离RNA？
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核酸简介
质粒(Plasmid)是一种 染色体外的稳定遗传因子， 大小从1-200 kb不等，为 双链、闭环的DNA分子， 并以超螺旋状态存在于宿 主细胞中。
4.实验材料
对数期菌株（pEGFP-N1 in DH5α）
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质粒DNA提取——碱裂解法
碱裂解法试剂配方
Ⅰ液 Ⅱ液 Ⅲ液
组分1 25 mM Tris-HCl （pH 8.0）
0.2 M NaOH 3 M KAc （pH 4.2）
组分2 10 mM EDTA（pH 8.0 ）
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀 水相中的DNA。 SDS法适用于大部分实验材料基因组DNA提取。如动物组
织、细胞、全血、细菌、酵母等。
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基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测
• 琼脂糖凝胶电泳：
• 以琼脂糖凝胶作为支持 物，利用DNA分子在泳 动时的电荷效应和分子 筛效应，达到分离混合 物的目的。