第3章蛋白质分离、纯化和表征

电泳迁移率(泳动度)
电场力 F = q × E = q × U/d 摩擦力 F f = f ×V
V/E=q/f 电泳迁移率(泳动度) m = V / E
蛋白质的泳动度 反映了一种蛋白质的特性
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Ⅱ不可逆沉淀 • 强烈沉淀条件 • 破坏Pr胶体溶液稳定性 • 也破坏Pr结构和性质 • 沉淀不能再重新溶解 ——变性沉淀 • 如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐
和生物碱沉淀等
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1.盐析法 加入中性盐脱去蛋白质的水化层， 盐析一般不引起变性
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盐溶盐溶—盐析
（一）根据分子大小不同的纯化方法
1、透析和超过滤 利用蛋白质分子不能透过半透膜将其
与小分子物质分开 半透膜为玻璃纸或纤维素材料
第3章蛋白质分离、纯化和表征
第3章蛋白质分离、纯化和表征
加
压
血液透析
血液
透析液
小分子溶出 小分子被带出
透析机
凝胶过滤
凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结 构一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小 的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外 洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液 体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程 长，后洗脱下来，洗脱体积大. 测定蛋白质分子量一 般用葡聚糖，商品名：Sephadex
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（二）利用溶解度差别的纯化方法
1.等电点沉淀 调整溶液pH 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀
2.盐溶和盐析
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2. 盐析 在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度
的强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠 等，可破坏蛋质分子表面的水化层，中和 它们的电荷，因而使蛋白质沉淀析出，这 种现象称为盐析。
要求纯度高，不变性； 2.提取活性的酶或蛋白质：
必须保持天然活性状态； 3.作为药物或食品添加剂：
纯度要求一般。 二、蛋白质提纯的总目标：
增加制品纯度或比活力，设法除去变性的 蛋白质和其他杂蛋白，且希望所得的蛋白质 的产量达到最高值。 第3章蛋白质分离、纯化和表征
三、蛋白质分离纯化的一般原则
总目标：增加制品纯度或比活 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有 机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换 层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶
在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子带 正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高于等 电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中 向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳—带电粒 子在电场中移动的现象。
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一、蛋白质的两性电离及等电点
蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大
电泳原理
• 蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0
• 分子大小不同，电场中移动速度也不同
蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电 点。在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质的溶解 度最小，在电场中不移动。 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在 等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电 场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质 粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称 为蛋白质电泳(Electrophoresis)。
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四、蛋白质的分离纯化方法
透析或超滤
百度文库
1、根据分子大小分 离心沉淀
沉降平衡离心法 沉降速度离心法
凝胶过滤层析
2、根据溶解度分
等电点沉淀 盐析（常用硫酸铵） 有机溶剂沉淀
3、根据电离性质分 电泳 离子交换层析
4、特异亲和力： 亲和层析
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五、蛋白质的分离纯化方法
蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗 运动以及不能通过半透膜等性质
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（二）蛋白质的沉淀
Pr从胶体溶液中析出 Ⅰ可逆沉淀：
– 温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷 – Pr结构和性质没有变化 – 适当条件下可重新溶解 ——非变性沉淀 • pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等
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• pI通常在 6.0 左右 第3章蛋白质分离、纯化和表征
二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
（一）胶体性质（colloidal system） 胶体溶液的特点： 分子直径在1-100 nm内 溶于水 不易聚集沉淀 大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液
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蛋白质胶体溶液的稳定因素： 1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥 2.水膜弹性
而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中， 会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为 盐溶。 盐析的机理：破坏蛋白质的水化膜，中和 表面的净电荷。 盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方 法不会使蛋白质产生变性。
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3.有机溶剂分级分离法 降低介电常数 争夺水化膜
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第3章 蛋白质的分离纯化和表征
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一、蛋白质的两性电离及等电点
蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使 某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两 性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴极移 动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点 （pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在 电场中不移动。
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4.重金属盐沉淀 与带负电荷蛋白质结成不溶性盐
5.生物碱试剂和某些酸类沉淀 与带正电荷蛋白质生成不溶性盐
6.加热变性沉淀 天然结构解体，疏水基外露， 破坏水化层及带电状态
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三、蛋白质分离纯化的一般原则
一. 分离纯化蛋白质的意义 1.研究蛋白质的结构与功能：
• 等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉 淀溶解—盐溶
• 原因？
分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少 量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶
于水中
盐析 盐析（（NH4）2SO4）
• 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质 会沉淀析出
• 原因？
蛋白质脱去水化层而聚集沉淀
2.有机溶剂沉淀 脱去水化层以及降低介电常数而增 加带电质点间的相互作用 3.等电点沉淀