实验一 银耳多糖的制备及分析-给学生

实验一银耳多糖的制备及分析

实验目的：

1. 学习真菌多糖类的分离、纯化原理。

2. 掌握多糖类物质的一般鉴定方法。

实验原理：

银耳（Tremella fuciformis）是我国一种传统的珍贵的真菌，具有滋补强壮、扶正固本之功效。银耳中含有的多糖类物质则具有明显提高机体免疫功能、抗炎症和抗放射等作用。

多糖（polysaccharides）的纯化方法很多，但必须根据目的物质的性质及条件选择合适的纯化方法。而且往往用一种方法不易得到理想的结果，因此必要时应考虑合用几种方法。1、乙醇沉淀法：乙醇沉淀法是制备黏多糖的最常用手段。乙醇的加入，改变了溶液的极性，导致糖溶解度下降。供乙醇沉淀的多糖溶液，其含多糖的浓度以1%----2%为佳。加完酒精，搅拌数小时，以保证多糖完全沉淀。沉淀物可用无水乙醇、丙酮、乙醚脱水，真空干燥即可得疏松粉末状产品。

2、分级沉淀法：不同多糖在不同浓度的甲醇、乙醇或丙酮中的溶解度不同，因此可用不同浓度的有机溶剂分级沉淀分子大小不同的黏多糖。

3、季铵盐络合法：黏多糖与一些阳离子表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和十六烷基氯化吡啶（CPC）等能形成季铵盐络合物。这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，在离子强度大时，这种络合物可以解离，溶解，释放。

本实验采用固体法培养获得的银耳子实体，经沸水抽提、氯仿—正丁醇法除蛋白质和乙醇沉淀分离可制得银耳多糖粗品，再用CTAB

（溴化十六烷基三甲铵）络合法进一步精制可得银耳多糖精品，然后进行定性分析。

实验内容与方法：

1、提取

将20g银耳实体和800ml水加入1000ml烧杯中，于沸水浴中加热搅拌8h，离心去残渣（3000r/min,25min）。上清液用硅藻土助滤，水洗，合并滤液后于80摄氏度水浴搅拌浓缩至糖浆状。然后加入1/4体积的氯仿—正丁醇溶液，摇匀，离心（3000r/min,10min）分层，再用分液漏斗分出下层氯仿和中层变性蛋白，然后重复去蛋白质操作2次。上清液用2moL/L氢氧化钠调至PH7.0，加热回流，用1%活性炭脱色，抽滤，上清液于80摄氏度水浴浓缩至原体积的1/3.然后加入3倍体积的95%乙醇，离心（3000r/min,15min），沉淀用无水乙醇洗涤2次，乙醚洗涤一次，真空干燥得银耳多糖粗品

2、纯化

取粗品1g，溶于100ml水中，溶解后离心（3000r/min,10min）除去不溶物，上清液加入2%CTAB溶液至沉淀完全，摇匀，静置4h，离心（3000r/min,10min）,沉淀用热水洗涤3次，加100ml 2mol/L 的氯化钠溶液于60摄氏度解离4h, 离心（3000r/min,10min），上清液扎袋流水透析12h，透析液于80摄氏度水浴浓缩，加3倍量95%乙醇，搅拌均匀后，离心（3000r/min,10min），沉淀再分别用无水乙醇，乙醚洗涤，真空干燥，得精品银耳多糖。

3、理化性质分析

将银耳多糖精品分别加入水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和正丁醇中，观察其溶解性。另外在浓硫酸存在的条件下观察银耳多糖与a—萘酚的作用，于界面出观察颜色变化。

4、含量测定

多糖在浓硫酸中水解后，进一步脱水生成醣醛类衍生物，与蒽酮作用形成有色化合物，进行比色测定。

请同学们（1）熟悉本次实验内容；

（2）在网上查阅测定多糖含量有几种方法；

（3）详细写出蒽酮-浓硫酸测定银耳多糖的实验步骤