DNA序列测定
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• 连同其他反应体系A+G、C+T、C的产物在 变性聚丙烯酰胺凝胶上相邻的加样孔中进行 电泳分离，放射性自显影后得到图谱，即可 识读出DNA序列。
• 由于种种原因（如采用 32P进行放射性 标记、末端标记DNA的比活度、裂解位 点的统计学分布、凝胶技术方面的局 限性等等），Maxam-Gilber法所能测 定的长度要比Sanger法短一些，它对 放射性标记末端250个核苷酸以内的 DNA序列效果最佳。
从头测序常用的方法有三种：
随机法 嵌套缺失法 引物延伸法
随机法（又称鸟枪法）
将长链DNA随机断裂成适于测序的片段，方 法可有超声波处理、核酸酶Ⅰ切割、限制性酶 切割等，将随机切割出的子片段分别插入到载 体的多克隆部位，进行克隆扩增，对不同的片 段分别测序，然后将他们重叠排列，便可连出 整体DNA的全长序列。或将个片段序列输入计算 机处理，可整合出整个DNA序列。
脱氧核苷酸及双脱氧核苷酸结构比较
• 这样以待测序列的DNA为模板，加入引物和 4种dNTP（其中一种为α -32P标记），将此 反应物分为4等份，每份内加入一定比例的 一种ddNTP，如此形成A、T、C、G四个反应 体系，最后在各反应体系中加入DNA聚合酶 催化DNA片段合成。这样各反应体系中即可 形成一种全部具有相同的5’-引物端和一 种以ddNTP残基为3’端结尾的一系列长短 不一片段。
长链DNA序列测定的基本策略
• 开始测序之前，必须根据待测序列区的长 度、所要求的测序精确度以及现有的设施 来制定测序总策略。只有一小部分的研究 计划需要从头测定大段从未测定过的序列， 而更多的情况是要通过测序对突变进行定 位和鉴定，并证实所构建的重组DNA的方向 与结构。根据目的的不同，大致有两种方 略。
THE PROCESS
A C T G G C C TAAT C G A G T C A G T TGAC C A T A T
G C
G G G
C
C
PE Applied Biosystems
PE Applied Biosystems
• 如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三 磷酸（ddNTP），它与普通dNTP不同，它的 戊糖的2’、3’-碳原子上均无-OH，由于 它具有5’-P-OH能与前一核苷酸的3’-OH 以磷酸二脂键相连，但因不具有3’-OH， 故不能同后续的dNTP相连，于是DNA链的合 成就此终止。
（二）从头测序
从头测序的目的是要提供一段DNA的准确核 苷酸序列，这一区段可长达数千碱基，而其 序列从来未经测定。由于单套测序反应所能 准确测定的靶DNA序列最长可达400碱基左右， 因此进行从头测序必须经过精心策划。
• 对长约400碱基的靶DNA可以按互为相反的方 向分别克隆于2种M13嗜菌体载体上。然后每 条链的全序列可以利用通用测序引物进行的 单套反应得以测定。 • 对长的DNA链进行测序只能将其分割成适合解 读长度的片段后分段测序，然后再合成完整 的长链DNA序列。
1．获得待测DNA片段的单链模板：
•
一般采用基因工程的方法以获取一定数量 的单链待测DNA模板。可将待测DNA片段与 噬菌体M13DNA进行重组，然后将其导入大 肠杆菌进行增殖，M13噬菌体一般以单链 DNA形式透出细胞再感染新的细菌，故此 可获得单链DNA模板。 通过PCR扩增获得待测模板
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• 化学降解较之链终止法具有一个明显 的优点：所测序列来自原DNA分子而不 是酶促合成所产生的拷贝。因此，利 用Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷 酸进行测序，可以分析诸如甲基化等 DNA修饰的情况。
• 但随着M13 噬菌体和噬菌粒载体的发 展，也由于现成的合成引物唾手可得 及测序反应日臻完善，双脱氧链终止 法如今远比Maxam-Gilbert法应用得广 泛。由于Sanger法既简便又快速，因 此是现今的最佳选择方案。事实上， 目前大多数测序策略都是为Sanger法 而设计的。
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•
然后在适当温度条件下延伸互补链，就 可得到四组分别以A、G、C、T、终止的 长短不一的互补链的混合物。因为在互 补链合成时，如掺入的是双脱氧核糖核 酸，由于缺乏3 `-OH，故可导致互补链 合成终止。
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•
将待测单链DNA模板、寡核苷酸引物、 DNA聚合酶，四种dNTP 、一种带放 射性同位素标记的脱氧核糖核酸 （如α -32P-dATP）混合。
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•
将上述杂交混合液均分为四份，每份混合 液 分别加入一种双脱氧核糖核酸（ddATP， ddGTP，ddCTP或ddTTP）。并在适当温度 条件下进行保温处理，使引物与DNA单链 模板的3'-端进行杂交。
• DNA测序技术是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳技术的基础上建立和发展起来的。 • 该凝胶含6%~8%丙烯酰胺，具有分离DNA片段的 分子筛效应,能分离仅有一个碱基差别,而长度 达300~500个碱基的寡核苷酸片段。 • 含有高浓度尿素，具有破坏氢键及防止氢键形 成的作用，以确保变性测序的DNA单链彼此不相 联接，也不因分子内形成氢键而折叠
（一）确证性测序
确证性测序(例如对利用寡核苷酸介导的诱变 而产生的突变体进行测序)往往只需要进行仅 仅一套反应，取得双链DNA其中一条链上局部 区域的核苷酸序列，通常只须对亚克隆于M13 噬菌体或噬菌体载体上的一段合适的限制酶切 片段进行测序，即可如愿以偿。
只要可能，应同时测定野生型基因上同源 区的序列和突变体的相应序列，直接在同 一张放射自显影片上对照有关序列，即有 助于确证变异区序列并将使突变体与野生 型基因之间任何出乎意料之外的其他差异 一目了然。
• 由此产生的一组具有各种不同长度的DNA链的 反应混合物。
• 最后，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影后， 便可根据X光片底板上所显现的相应谱带，直 接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。
• 例如：
• 在G反应体系中，DNA在任意位置的鸟嘌呤
处断裂，产生一组一端为放射性标记的固定 末端，另一端为鸟嘌呤的不同大小的DNA片 段混合物。他们的长度可以从数个核苷酸到 接近待测DNA全长。
•
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2．合成寡核苷酸引物：
•
在待测DNA片段的3’-端合成一段互补的 寡核苷酸引物，其顺序可为待测DNA片段 3’-端的一段已知顺序，也可为一段M13 噬菌体的顺序。可利用DNA合成仪自动合 成。（待后讨论）
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3．测序反应
Sanger双脱氧核苷酸链 末端终止法
1958年和1980 年诺贝尔化学 奖获得者英国 生物化学家弗 雷德时里克· 桑 格
基本原理：
• 通常DNA的复制需要：DNA聚合酶，单链 DNA模板，带有3‘-OH末端的单链寡核苷酸 引物，4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和 dCTP）。聚合酶用模板作指导，不断地将 dNTP加到引物的3’-OH末端（新掺入的脱 氧核苷酸5’-P-OH与前一核苷酸的3’-OH以 磷酸二脂键相连），使引物延伸，合成出新 的互补DNA链。
4．电泳分离：
•
将四组含有长短不等的反应混合物在同 一聚丙烯酰胺凝胶板上进行电泳，即可 将只相差一个核苷酸的寡核苷酸链分离 开。
PE Applied Biosystems
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6．放射自显影：
•
将电泳凝胶与X光胶片压在一起，于低 温下自显影数天，即可得到放射自显图 谱，通过该图谱即可直接读出核苷酸的 排列顺序。
全基因组鸟枪法测序的主要步骤
• 第一，建立高度随机、插入片段大小为2kb 左右的基因组文库。克隆数要达到一定数量， 即经末端测序的克隆片段的碱基总数应达到 基因组5倍以上。
• 第二，高效、大规模的末端测序。
• 第三，序列集合。 • 第四，填补缺口。
全基因组鸟枪法测序的拼接
困难：
1、数据量极大:对众多子片段克隆、测序， 通常要测定比实际DNA所含核苷酸数多几 倍的序列 2、大量重复序列造成拼接途径的不确定 3、难免遇到某些片段的序列出现多次而 有的片段部分不出现的现象
C C A A C
A T
G
C
A
G
T
A
C
PE Applied Biosystems
PE Applied Biosystems
PE Applied Biosystems
PE Applied Biosystems
PE Applied Biosystems
双脱氧末端终止法的主要操 作步骤
PE Applied Biosystems
待测DNA片段 生成系列相差 一个碱基的DNA 片段
TGGAACCTC TGGAACCT TGGAACC TGGAAC TGGAA TGGA TGG TG T
TGGAACCT TGGAACC TGGAAC TGGAA TGGA TGG TG T
+
• 目前应用的两种快速序列测定技术: • Sanger等（1977年）提出的酶法-双脱 氧链终止法 • Maxam和Gilbert（1977年）提出的化 学降解法 • 其中双脱氧链终止法是目前DNA序列分 析应用最多最好的方法
DNA序列测定
讲课内容：
• 一、Sanger双脱氧核苷酸链末端终止 法原理 • 二、化学裂解法原理 • 三、长链DNA序列测定的基本策略 • 四、DNA的序列分析的自动化 • 五、310 型DNA测序仪测定DNA序列的 基本步骤
• DNA序列测定，是指DNA一级 结构的测定，即DNA分子中 核苷酸的排列顺序的测定。 是现代分子生物学中一项重 要技术。
Polymerase
Terminator
A
G
C
T
PE Applied Biosystems
RADIOACTIVE METHOD
Leabharlann Baidu
PE Applied Biosystems
THE PROCESS
A C T G G C C TAAT C G A G T C A G T TGACCGGA T
G C
T G T G G T
嵌套缺失法（又称互套缺失法）
该法基本原理是基因DNA链的一端与载体相连固 定，另一端在核酸外切酶的作用下随着时间的延长， 较匀速地消化变短，这样可人为获得一组长度不等 的从一端开始缺失的DNA片段。然后从缺失端开始 测序，这样每段的基因起始部分的序列总是与前一 基因片段序列的后面部分重合，这样彼此套接可以 很准确地测出整个基因的DNA序列。
DNA模板 生成的新链
ATTGCAGTCGAC TAACGTCAGCTG
C管： TAACGTCAGC TAACGTC TAAC
A管： TAACGTCA TAA TA
T管： TAACGTCAGCT TAACGT T
G管： TAACGTCAGCTG TAACGTCAG TAACG
• 将制得的四组混合物全部平行地点加在变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳，每组一 泳道，四条泳道相邻并列，每条泳道上按产 物分子量小→大从正极到负极（胶板的下→ 上）分离开来，依次排列。 • 由于各产物均带有放射性标记，以上结果经 放射自显影，从而制得相应的放射性自显影 图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序 列。
PE Applied Biosystems
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化学裂解法
（Maxam－Gilbert
DNA序列分析法）
沃尔特· 吉尔伯特
基本原理及步骤：
• 首先，对待测DNA片段进行单侧末端的放射性 核素标记。 • 其次，标记后的DNA分成4~5个反应体系，分 别用不同的化学试剂处理，使DNA片段分别于 某一种或某一类碱基础断裂，并且控制化学反 应进程，使得平均每个DNA分子只在1个位置断 裂，而断裂的位置随机发生在DNA片段某种碱 基中的任何一个。
• • • • • •
•
• •
•
•
TAACGTCAGCTG TAACGTCAGCT TAACGTCAGC TAACGTCAG TAACGTCA TAACGTC TAACGT TAACG TAAC TAA TA T
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Template
dATP
Primer
dNTP
• 由于种种原因（如采用 32P进行放射性 标记、末端标记DNA的比活度、裂解位 点的统计学分布、凝胶技术方面的局 限性等等），Maxam-Gilber法所能测 定的长度要比Sanger法短一些，它对 放射性标记末端250个核苷酸以内的 DNA序列效果最佳。
从头测序常用的方法有三种：
随机法 嵌套缺失法 引物延伸法
随机法（又称鸟枪法）
将长链DNA随机断裂成适于测序的片段，方 法可有超声波处理、核酸酶Ⅰ切割、限制性酶 切割等，将随机切割出的子片段分别插入到载 体的多克隆部位，进行克隆扩增，对不同的片 段分别测序，然后将他们重叠排列，便可连出 整体DNA的全长序列。或将个片段序列输入计算 机处理，可整合出整个DNA序列。
脱氧核苷酸及双脱氧核苷酸结构比较
• 这样以待测序列的DNA为模板，加入引物和 4种dNTP（其中一种为α -32P标记），将此 反应物分为4等份，每份内加入一定比例的 一种ddNTP，如此形成A、T、C、G四个反应 体系，最后在各反应体系中加入DNA聚合酶 催化DNA片段合成。这样各反应体系中即可 形成一种全部具有相同的5’-引物端和一 种以ddNTP残基为3’端结尾的一系列长短 不一片段。
长链DNA序列测定的基本策略
• 开始测序之前，必须根据待测序列区的长 度、所要求的测序精确度以及现有的设施 来制定测序总策略。只有一小部分的研究 计划需要从头测定大段从未测定过的序列， 而更多的情况是要通过测序对突变进行定 位和鉴定，并证实所构建的重组DNA的方向 与结构。根据目的的不同，大致有两种方 略。
THE PROCESS
A C T G G C C TAAT C G A G T C A G T TGAC C A T A T
G C
G G G
C
C
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PE Applied Biosystems
• 如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三 磷酸（ddNTP），它与普通dNTP不同，它的 戊糖的2’、3’-碳原子上均无-OH，由于 它具有5’-P-OH能与前一核苷酸的3’-OH 以磷酸二脂键相连，但因不具有3’-OH， 故不能同后续的dNTP相连，于是DNA链的合 成就此终止。
（二）从头测序
从头测序的目的是要提供一段DNA的准确核 苷酸序列，这一区段可长达数千碱基，而其 序列从来未经测定。由于单套测序反应所能 准确测定的靶DNA序列最长可达400碱基左右， 因此进行从头测序必须经过精心策划。
• 对长约400碱基的靶DNA可以按互为相反的方 向分别克隆于2种M13嗜菌体载体上。然后每 条链的全序列可以利用通用测序引物进行的 单套反应得以测定。 • 对长的DNA链进行测序只能将其分割成适合解 读长度的片段后分段测序，然后再合成完整 的长链DNA序列。
1．获得待测DNA片段的单链模板：
•
一般采用基因工程的方法以获取一定数量 的单链待测DNA模板。可将待测DNA片段与 噬菌体M13DNA进行重组，然后将其导入大 肠杆菌进行增殖，M13噬菌体一般以单链 DNA形式透出细胞再感染新的细菌，故此 可获得单链DNA模板。 通过PCR扩增获得待测模板
PE Applied Biosystems
• 化学降解较之链终止法具有一个明显 的优点：所测序列来自原DNA分子而不 是酶促合成所产生的拷贝。因此，利 用Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷 酸进行测序，可以分析诸如甲基化等 DNA修饰的情况。
• 但随着M13 噬菌体和噬菌粒载体的发 展，也由于现成的合成引物唾手可得 及测序反应日臻完善，双脱氧链终止 法如今远比Maxam-Gilbert法应用得广 泛。由于Sanger法既简便又快速，因 此是现今的最佳选择方案。事实上， 目前大多数测序策略都是为Sanger法 而设计的。
PE Applied Biosystems
•
然后在适当温度条件下延伸互补链，就 可得到四组分别以A、G、C、T、终止的 长短不一的互补链的混合物。因为在互 补链合成时，如掺入的是双脱氧核糖核 酸，由于缺乏3 `-OH，故可导致互补链 合成终止。
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PE Applied Biosystems
•
将待测单链DNA模板、寡核苷酸引物、 DNA聚合酶，四种dNTP 、一种带放 射性同位素标记的脱氧核糖核酸 （如α -32P-dATP）混合。
PE Applied Biosystems
•
将上述杂交混合液均分为四份，每份混合 液 分别加入一种双脱氧核糖核酸（ddATP， ddGTP，ddCTP或ddTTP）。并在适当温度 条件下进行保温处理，使引物与DNA单链 模板的3'-端进行杂交。
• DNA测序技术是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳技术的基础上建立和发展起来的。 • 该凝胶含6%~8%丙烯酰胺，具有分离DNA片段的 分子筛效应,能分离仅有一个碱基差别,而长度 达300~500个碱基的寡核苷酸片段。 • 含有高浓度尿素，具有破坏氢键及防止氢键形 成的作用，以确保变性测序的DNA单链彼此不相 联接，也不因分子内形成氢键而折叠
（一）确证性测序
确证性测序(例如对利用寡核苷酸介导的诱变 而产生的突变体进行测序)往往只需要进行仅 仅一套反应，取得双链DNA其中一条链上局部 区域的核苷酸序列，通常只须对亚克隆于M13 噬菌体或噬菌体载体上的一段合适的限制酶切 片段进行测序，即可如愿以偿。
只要可能，应同时测定野生型基因上同源 区的序列和突变体的相应序列，直接在同 一张放射自显影片上对照有关序列，即有 助于确证变异区序列并将使突变体与野生 型基因之间任何出乎意料之外的其他差异 一目了然。
• 由此产生的一组具有各种不同长度的DNA链的 反应混合物。
• 最后，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影后， 便可根据X光片底板上所显现的相应谱带，直 接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。
• 例如：
• 在G反应体系中，DNA在任意位置的鸟嘌呤
处断裂，产生一组一端为放射性标记的固定 末端，另一端为鸟嘌呤的不同大小的DNA片 段混合物。他们的长度可以从数个核苷酸到 接近待测DNA全长。
•
PE Applied Biosystems
2．合成寡核苷酸引物：
•
在待测DNA片段的3’-端合成一段互补的 寡核苷酸引物，其顺序可为待测DNA片段 3’-端的一段已知顺序，也可为一段M13 噬菌体的顺序。可利用DNA合成仪自动合 成。（待后讨论）
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3．测序反应
Sanger双脱氧核苷酸链 末端终止法
1958年和1980 年诺贝尔化学 奖获得者英国 生物化学家弗 雷德时里克· 桑 格
基本原理：
• 通常DNA的复制需要：DNA聚合酶，单链 DNA模板，带有3‘-OH末端的单链寡核苷酸 引物，4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和 dCTP）。聚合酶用模板作指导，不断地将 dNTP加到引物的3’-OH末端（新掺入的脱 氧核苷酸5’-P-OH与前一核苷酸的3’-OH以 磷酸二脂键相连），使引物延伸，合成出新 的互补DNA链。
4．电泳分离：
•
将四组含有长短不等的反应混合物在同 一聚丙烯酰胺凝胶板上进行电泳，即可 将只相差一个核苷酸的寡核苷酸链分离 开。
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6．放射自显影：
•
将电泳凝胶与X光胶片压在一起，于低 温下自显影数天，即可得到放射自显图 谱，通过该图谱即可直接读出核苷酸的 排列顺序。
全基因组鸟枪法测序的主要步骤
• 第一，建立高度随机、插入片段大小为2kb 左右的基因组文库。克隆数要达到一定数量， 即经末端测序的克隆片段的碱基总数应达到 基因组5倍以上。
• 第二，高效、大规模的末端测序。
• 第三，序列集合。 • 第四，填补缺口。
全基因组鸟枪法测序的拼接
困难：
1、数据量极大:对众多子片段克隆、测序， 通常要测定比实际DNA所含核苷酸数多几 倍的序列 2、大量重复序列造成拼接途径的不确定 3、难免遇到某些片段的序列出现多次而 有的片段部分不出现的现象
C C A A C
A T
G
C
A
G
T
A
C
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双脱氧末端终止法的主要操 作步骤
PE Applied Biosystems
待测DNA片段 生成系列相差 一个碱基的DNA 片段
TGGAACCTC TGGAACCT TGGAACC TGGAAC TGGAA TGGA TGG TG T
TGGAACCT TGGAACC TGGAAC TGGAA TGGA TGG TG T
+
• 目前应用的两种快速序列测定技术: • Sanger等（1977年）提出的酶法-双脱 氧链终止法 • Maxam和Gilbert（1977年）提出的化 学降解法 • 其中双脱氧链终止法是目前DNA序列分 析应用最多最好的方法
DNA序列测定
讲课内容：
• 一、Sanger双脱氧核苷酸链末端终止 法原理 • 二、化学裂解法原理 • 三、长链DNA序列测定的基本策略 • 四、DNA的序列分析的自动化 • 五、310 型DNA测序仪测定DNA序列的 基本步骤
• DNA序列测定，是指DNA一级 结构的测定，即DNA分子中 核苷酸的排列顺序的测定。 是现代分子生物学中一项重 要技术。
Polymerase
Terminator
A
G
C
T
PE Applied Biosystems
RADIOACTIVE METHOD
Leabharlann Baidu
PE Applied Biosystems
THE PROCESS
A C T G G C C TAAT C G A G T C A G T TGACCGGA T
G C
T G T G G T
嵌套缺失法（又称互套缺失法）
该法基本原理是基因DNA链的一端与载体相连固 定，另一端在核酸外切酶的作用下随着时间的延长， 较匀速地消化变短，这样可人为获得一组长度不等 的从一端开始缺失的DNA片段。然后从缺失端开始 测序，这样每段的基因起始部分的序列总是与前一 基因片段序列的后面部分重合，这样彼此套接可以 很准确地测出整个基因的DNA序列。
DNA模板 生成的新链
ATTGCAGTCGAC TAACGTCAGCTG
C管： TAACGTCAGC TAACGTC TAAC
A管： TAACGTCA TAA TA
T管： TAACGTCAGCT TAACGT T
G管： TAACGTCAGCTG TAACGTCAG TAACG
• 将制得的四组混合物全部平行地点加在变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳，每组一 泳道，四条泳道相邻并列，每条泳道上按产 物分子量小→大从正极到负极（胶板的下→ 上）分离开来，依次排列。 • 由于各产物均带有放射性标记，以上结果经 放射自显影，从而制得相应的放射性自显影 图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序 列。
PE Applied Biosystems
PE Applied Biosystems
化学裂解法
（Maxam－Gilbert
DNA序列分析法）
沃尔特· 吉尔伯特
基本原理及步骤：
• 首先，对待测DNA片段进行单侧末端的放射性 核素标记。 • 其次，标记后的DNA分成4~5个反应体系，分 别用不同的化学试剂处理，使DNA片段分别于 某一种或某一类碱基础断裂，并且控制化学反 应进程，使得平均每个DNA分子只在1个位置断 裂，而断裂的位置随机发生在DNA片段某种碱 基中的任何一个。
• • • • • •
•
• •
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TAACGTCAGCTG TAACGTCAGCT TAACGTCAGC TAACGTCAG TAACGTCA TAACGTC TAACGT TAACG TAAC TAA TA T
PE Applied Biosystems
Template
dATP
Primer
dNTP