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转化子的筛选与重组子的鉴定
www.themegallery.com
为什么要进行转化子的筛选和重组 子的鉴定？
在DNA体外重组实验中，外源DNA片段与载体DNA的连接反应物 一般不经分离直接用于转化，再加上重组率和转化率的不理想，因此 必须通过筛选和鉴定来区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、 期望重组子与非期望重组子。
工作原理：
受体基因组
转化子 重组子
非期望 期望重 重组子 组子
转化子 期望重组子
非整合子 整合子
菌落原位杂交法
菌落原位杂交法（又称探针原位杂交法）能从成 千上万个转化子中迅速检测出期望重组子，其前 提条件是必须拥有与目的基因某一区域同源的探 针序列。根据核酸杂交原理，探针序列特异性的 杂交目的基因，并通过放射性同位素或荧光基团 进行定位检测。
❖转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。 ❖非转化子：为接纳载体或重组分子的非转化细胞。 ❖重组子：含有重组DNA分子的转化子。 ❖非重组子：仅含有空载载体分子的转化子。 ❖期望重组子：含有目的基因的重组子。 ❖非期望重组子：不含目的基因的重组子。
三者的关系
期望重组子 重组子 转化子
转化子的筛选与重组子的鉴定方法
lacZ' ori
pUC18
Apr
噬菌斑筛选法
1.取代型载体 噬菌斑中的λ噬菌体即为重组子。 2.插入型载体 根据载体上的标记基因筛选。（如：lacZ′）
重组子 非重组子
基于克隆片段序列的筛选与鉴定
PCR鉴定法 菌落原位杂交法 限制性酶切图谱法 亚克隆法 DNA序列测定法
PCR鉴定法
PCR技术的两大主要用途为目的基因的获得和DNA 特定序列的检测。根据引物互补区域的不同，PCR 技术即可用于区分重组子与非重组子，也能鉴定 期望重组子与非期望重组子，甚至还能探测目的 基因或DNA片段是否整合在受体细胞的基因组上。 上述PCR鉴定程序一般需要将筛选平板上的单菌落 分别挑出进一步培养，因此不太适用于成千上万 个转化子的鉴定。
在 Ap 平 板 上 生 长 、 但 在 Ap+Tc平板上不长的转化子 为重组子
Ap
挑
影
选
印
Ap+Tc
营养缺陷性筛选法
基本原理：
营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组 子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因， 而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养 组份的培养基上，长出的便是转化子 。
非重组子：Apr、Tcr
重组子：Aps、Tcs
EcoR I Cla I
Pst I Hind III
Pvu I
BamH I
Pst I Ap r
Tcr
Sal I
pBR322
4363 bp
ROI
ori
ROP
Bal I
Hind II
基本操作： 将转化液涂布含Ap的平板
再将Ap平板上的转化子影印 至含有Ap和Tc的平板上
缺刻前移标记法
5＇ 5＇ 5＇ 5＇
5＇
5＇
DNase I
5＇
DNA聚合酶I
5＇
dNTP、[α-32wenku.baidu.com]dATP
5＇
变性
5＇
限制性酶切图谱法
所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源 DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已 知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非 重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于 数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高 。
基本原理图示：
Lys−
Lys+
Lys−
Lys+
常见的营养缺陷型筛选标记：
用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+ 用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk， 相应的受体细胞则选择tk-缺陷型 哺乳动物细胞中存在两条dTTP的合成途径：
dCDP
AP
dTDP
❖基于外源基因表达产物的筛选与鉴定
如果克隆在受体细胞中的外源基因编码产物是蛋白质，则可通过 检测这种蛋白质的生物功能或结构来筛选和鉴定期望重组子
基于载体遗传标记的筛选与鉴定
抗药性筛选法 营养缺陷性筛选法 显色模板筛选法 噬菌斑筛选法
抗药性筛选法
可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。
将外源DNA片段 插入BamH I、Sal I位点
单位长度探针标记的同位素越多，杂交反应灵敏度就越高。
探针标记方法：
1、5＇端标记法。 2、反转录标记法。 3、缺刻前移标记。 4、ABC标记法。
5＇端标记法
P
T4-PNP酶
P P
DTT、Mg2+、 [γ-32P]dATP、过量ADP
P P
P
变性制备单链探针 方法1
P
碱性磷酸酶
T4-PNP酶
P
方法2
显色筛选法的基本操作：
将 外 源 基 因 克 隆 在 pUC18 的 lacZ’ 标 记 基 因 内 部 ， 使 之 灭 活 ， 此 时 重 组 子 呈 Apr 、 lacZ- ， 淡 黄 色 菌 落 ； 而 非 重 组 子 则 呈 Apr
Ap + X-gal
、lacZ+，蓝色菌落
重组子（Apr + lacZ-）
dTTP
AP 氨基喋呤 TK 胸腺嘧啶核苷激酶
TK
TR
dTMP
dTDP
dTTP
显色模型筛选法
基本原理：
显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非 重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物 能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒 pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的 melC基因（黑色反应）等。
❖基于载体遗传标记的筛选与鉴定
利用载体DNA分子上所携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或 重组子
❖基于克隆片段序列的筛选与鉴定
由于基于载体遗传的筛选与鉴定程序不能区分期望重组子与非期 望重组子。在大多数情况下，待克隆的目的基因或DNA片段的序列至 少部分是已知的，因此根据克隆片段序列设计的筛选与鉴定程序具有 广泛的实用性
原位杂交的操作程序
探针的制备
探针的长度以及与目的基因之间的序列同源性是杂交实验成败的关键 最佳的探针长度范围为100~1000bp 探针内部不能含有大面积的互补序列，会直接影响探针与DNA靶序列的杂交。
探针的获取方法：
1、目的基因的同源序列 2、cDNA 3、人工合成
探针的标记
探针在杂交后是通过其分子中的放射性同位素或荧光基团进行定位 示踪的，放射性的强弱直接关系到杂交反应的灵敏度。
转化子的筛选与重组子的鉴定
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为什么要进行转化子的筛选和重组 子的鉴定？
在DNA体外重组实验中，外源DNA片段与载体DNA的连接反应物 一般不经分离直接用于转化，再加上重组率和转化率的不理想，因此 必须通过筛选和鉴定来区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、 期望重组子与非期望重组子。
工作原理：
受体基因组
转化子 重组子
非期望 期望重 重组子 组子
转化子 期望重组子
非整合子 整合子
菌落原位杂交法
菌落原位杂交法（又称探针原位杂交法）能从成 千上万个转化子中迅速检测出期望重组子，其前 提条件是必须拥有与目的基因某一区域同源的探 针序列。根据核酸杂交原理，探针序列特异性的 杂交目的基因，并通过放射性同位素或荧光基团 进行定位检测。
❖转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。 ❖非转化子：为接纳载体或重组分子的非转化细胞。 ❖重组子：含有重组DNA分子的转化子。 ❖非重组子：仅含有空载载体分子的转化子。 ❖期望重组子：含有目的基因的重组子。 ❖非期望重组子：不含目的基因的重组子。
三者的关系
期望重组子 重组子 转化子
转化子的筛选与重组子的鉴定方法
lacZ' ori
pUC18
Apr
噬菌斑筛选法
1.取代型载体 噬菌斑中的λ噬菌体即为重组子。 2.插入型载体 根据载体上的标记基因筛选。（如：lacZ′）
重组子 非重组子
基于克隆片段序列的筛选与鉴定
PCR鉴定法 菌落原位杂交法 限制性酶切图谱法 亚克隆法 DNA序列测定法
PCR鉴定法
PCR技术的两大主要用途为目的基因的获得和DNA 特定序列的检测。根据引物互补区域的不同，PCR 技术即可用于区分重组子与非重组子，也能鉴定 期望重组子与非期望重组子，甚至还能探测目的 基因或DNA片段是否整合在受体细胞的基因组上。 上述PCR鉴定程序一般需要将筛选平板上的单菌落 分别挑出进一步培养，因此不太适用于成千上万 个转化子的鉴定。
在 Ap 平 板 上 生 长 、 但 在 Ap+Tc平板上不长的转化子 为重组子
Ap
挑
影
选
印
Ap+Tc
营养缺陷性筛选法
基本原理：
营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组 子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因， 而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养 组份的培养基上，长出的便是转化子 。
非重组子：Apr、Tcr
重组子：Aps、Tcs
EcoR I Cla I
Pst I Hind III
Pvu I
BamH I
Pst I Ap r
Tcr
Sal I
pBR322
4363 bp
ROI
ori
ROP
Bal I
Hind II
基本操作： 将转化液涂布含Ap的平板
再将Ap平板上的转化子影印 至含有Ap和Tc的平板上
缺刻前移标记法
5＇ 5＇ 5＇ 5＇
5＇
5＇
DNase I
5＇
DNA聚合酶I
5＇
dNTP、[α-32wenku.baidu.com]dATP
5＇
变性
5＇
限制性酶切图谱法
所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源 DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已 知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非 重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于 数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高 。
基本原理图示：
Lys−
Lys+
Lys−
Lys+
常见的营养缺陷型筛选标记：
用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+ 用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk， 相应的受体细胞则选择tk-缺陷型 哺乳动物细胞中存在两条dTTP的合成途径：
dCDP
AP
dTDP
❖基于外源基因表达产物的筛选与鉴定
如果克隆在受体细胞中的外源基因编码产物是蛋白质，则可通过 检测这种蛋白质的生物功能或结构来筛选和鉴定期望重组子
基于载体遗传标记的筛选与鉴定
抗药性筛选法 营养缺陷性筛选法 显色模板筛选法 噬菌斑筛选法
抗药性筛选法
可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。
将外源DNA片段 插入BamH I、Sal I位点
单位长度探针标记的同位素越多，杂交反应灵敏度就越高。
探针标记方法：
1、5＇端标记法。 2、反转录标记法。 3、缺刻前移标记。 4、ABC标记法。
5＇端标记法
P
T4-PNP酶
P P
DTT、Mg2+、 [γ-32P]dATP、过量ADP
P P
P
变性制备单链探针 方法1
P
碱性磷酸酶
T4-PNP酶
P
方法2
显色筛选法的基本操作：
将 外 源 基 因 克 隆 在 pUC18 的 lacZ’ 标 记 基 因 内 部 ， 使 之 灭 活 ， 此 时 重 组 子 呈 Apr 、 lacZ- ， 淡 黄 色 菌 落 ； 而 非 重 组 子 则 呈 Apr
Ap + X-gal
、lacZ+，蓝色菌落
重组子（Apr + lacZ-）
dTTP
AP 氨基喋呤 TK 胸腺嘧啶核苷激酶
TK
TR
dTMP
dTDP
dTTP
显色模型筛选法
基本原理：
显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非 重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物 能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒 pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的 melC基因（黑色反应）等。
❖基于载体遗传标记的筛选与鉴定
利用载体DNA分子上所携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或 重组子
❖基于克隆片段序列的筛选与鉴定
由于基于载体遗传的筛选与鉴定程序不能区分期望重组子与非期 望重组子。在大多数情况下，待克隆的目的基因或DNA片段的序列至 少部分是已知的，因此根据克隆片段序列设计的筛选与鉴定程序具有 广泛的实用性
原位杂交的操作程序
探针的制备
探针的长度以及与目的基因之间的序列同源性是杂交实验成败的关键 最佳的探针长度范围为100~1000bp 探针内部不能含有大面积的互补序列，会直接影响探针与DNA靶序列的杂交。
探针的获取方法：
1、目的基因的同源序列 2、cDNA 3、人工合成
探针的标记
探针在杂交后是通过其分子中的放射性同位素或荧光基团进行定位 示踪的，放射性的强弱直接关系到杂交反应的灵敏度。