方法学评价试验——重复性试验(TP)

血清(浆)总蛋白(TP)测定
蛋白ห้องสมุดไป่ตู้检测方法
免疫化学法
利用抗原抗体特异反应 免疫比浊法、免疫扩散法、免疫沉淀法、免疫化学法等
方法学评价试验---重复性试验
实验原理
蛋白质分子中的肽键在碱性条件下，与Cu2+产生稳定的 紫红色络合物。与两分子尿素缩合后生成的双缩脲在碱性 溶液中与Cu2+的反应相似，故称为双缩脲反应。络合物颜色 的深浅在一定范围内与蛋白质的浓度成正比（与蛋白质分 子量及氨基酸成分无关），与同样处理的蛋白质标准液比 较，经计算即可求出血清总蛋白质含量。
血清(浆)总蛋白(TP)测定
蛋白质检测方法
化学法
18早83期年用建于立酪，氨是酸经和典色的氨蛋酸白的质定测量
此定法测方操定法作。。简该该便方法、法结准较果确双准、缩确重脲，复法精性反密好应度，灵
凯式定氮法（N）
干高扰敏，物1灵质00敏少倍度(左硫低右酸，，铵适检；用测Tr于i范s缓0围.2冲~最1液.低0；m可g某达
4．自动生化分析仪或722型分光光度计，刻度吸管，试管， 试管架，微量加样器，恒温水浴箱等
血清(浆)总蛋白(TP)测定
操作步骤
将以上收集的样本分为20份并进行编号，按下表操作：
加入物 蒸馏水（μl）
空白管（B） 标准管（S） 测定管（U1~20）
20
—
—
蛋白标准液（μl）
—
20
—
待测血清（μl）
—
血清(浆)总蛋白(TP)测定
血清总蛋白质检测有何临床意义？
血清总蛋白质（ total protein ，TP）是血清中各种蛋白质的总称， 是血浆固体成分中含量最多的一类物质，具有维持血液正常胶体渗透压和 pH、运输多种代谢物、免疫、催化、营养作用等多种功能。 90%以上的血 清总蛋白由肝脏合成，如清蛋白、a1、a2、β球蛋白，纤维蛋白原等，当 肝脏发生病变时，肝细胞合成蛋白质的功能减退，血浆中蛋白质即会发生 质和量的变化。临床上用各种方法检测血浆蛋白的含量来协助诊断肝脏疾 患，并作为疗效观察，预后判断的指标。
方法学评价试验---重复性试验
批内重复性试验是将同一材料分成数份实验标本， 在尽可能短的时间内平行测定20次；
日内重复性试验是将同一材料分成数份实验标本， 在1天内作5轮，每轮4次测定，获得20个测定数据；
日间重复性试验是将同一材料分成20份实验标本， 每天测定1份，连测20天。
分别作统计处理即可测得候选方法的批内、日内和 日间的随机误差。
些氮氨5测基μg定酸，，)通，是常在蛋为10白2~01质~220测5g0/定μL浓g的，度参使范考用围方很内广
双缩脲法（肽键）
成法良泛，好，但的但由线花于形费操关时作系间复，长杂批（、内4费C0V~时值60＜分2钟%）。，
其（缺干8点~扰1是0因h灵）素敏，较度影多较响(低硫因(酸1素~铵2较0；m少gT)（，ri主不s缓要同冲
方法学评价试验---重复性试验
方法学评价试验---重复性试验
例如：某次室间质量评价活动中，血清氯的靶值为98mmol/L， 实验室A测得结果为101mmol/L，CCV为2.2，该室血清氯检测 得分为： V＝(101－98)×100/98＝3.06 VI＝3.06×100/2.2＝139 此时VI＜400，VIS＝VI＝139。该室即得分的139。 一般情况下，VIS只计整数位，并不带正负符号。
方法学评价试验---重复性试验
试剂与器材
1.样本：收集无溶血、无脂浊、无传染性疾病、肝肾功能
正常的人混合血清。
2．双缩脲试剂 硫酸铜 2.0mmol/L 酒石酸钾钠 31.9mmol/L 碘化钾 30.1mmol/L 氢氧化钠 600mmol/L
3．蛋白标准液
酒石酸钾钠可以与Cu2+形成络合物， 并维持Cu2+在碱性溶液中的稳定性， 避免形成Cu(OH)2沉淀使试剂失效。 碘化钾是抗氧化剂，防止Cu2+还原， 从而延长试剂的使用寿命。 氢氧化钾仅仅是为了提供碱性环 境，因此它可被其他碱，如氢氧 化钠所代替。
血清(浆)总蛋白(TP)测定
蛋白质检测方法
染料结合法
邻苯三酚红钼也可用于测定尿液、脑脊液蛋白质含量， 既不粘附比色杯 ,又具有高灵敏度，已有用于自动化分析 测定尿液蛋白质的试剂盒。 还有测定Alb常用的染料甲基橙、溴甲酚紫(BCP)、溴甲 酚绿（BCG）等，目前应用最广的是BCG。此法操作简便， 灵敏度高，重复性好，适合自动分析；且球蛋白一般与阴 离子染料不结合，无干扰作用。是清蛋白测定的常规方法， 应用最广。
—
20
双缩脲试剂(ml)
1.0
1.0
1.0
混匀，置37℃水浴10min，以空白管调零，用540nm波长比 色，读取各管吸光度值(A值)并计算。
方法学评价试验---重复性试验
结果计算
1.根据以下公式求出各个测定管（U1~20）的血清总 蛋白的浓度：
血清TP(g / L)
AU AS
C S(g / L)
方法学评价试验---重复性试验
结果及讨论
2.根据以下公式求出均值和标准差s：
n
xi
x i1 n
n
2
xi x
s i1 n 1
n
表示各测定值总和；i=1表示从第1个样本值开始加，
i 1
加到第n个x值，本实验共20个测定值。
方法学评价试验---重复性试验
结果及讨论
3.离群值检验 用求得的均值和标准差对20个测定值进行 检验，如果其中有一个数据超过X±3S时，该数据为离群值。 剔除该数据后补做一个实验数据后重新计算X和s。有两个 以上离群值时，重新进行实验，本次实验作废。
方法学评价试验---重复性试验
方法学评价常用技术性能指标
准确度(accuracy)是指测定值与真值之间的 符合程度，由于真值实际上也是一个近似值，所 以准确度往往用不准确度来表示。
精密度(precision)是指在重复性条件下对同 一标本进行多次测定时，各测定值之间随机误差 的大小。精密度常用标准差(s)或变异系数(CV%) 来表示。
方法学评价试验---重复性试验
方法学评价试验
——重复性试验
实验目的与要求
掌握：批内精密度评价的基本原理、实验步骤及 统计方法。 熟悉：重复性实验的注意事项和评价标准。 了解：批间、日内及日间重复性实验的区别
方法学评价试验---重复性试验
什么是方法学评价
方法学评价（evalution of methodology）是 通过实验的途径客观评价实验方法及其试剂分析性能 的重要手段。其基本内容是通过实验途径，测定并评 价方法的精密度与准确度，在实验中测定的是不精密 度与不准确度，不论精密度还是准确度，强调的都是 误差，评价实验的过程就是对误差的测定。
酚试剂法（Lowry法） 蛋为白液非质；蛋显甘白色氨氮相酸，似，但，各可但种用能硫三满醇氯足)乙临，酸床颜沉要色深
比浊法（沉淀）
求淀，浅蛋是随白目不质前同而临蛋分床白离测质）定变，蛋化不白，适质较用的适于一合常种单 首规选一测方蛋定法白，。质目测前定多。用近于年蛋来白逐质渐的被定考
值马和斯校亮正兰其法他所方取法代。。（（测灵定敏准度确好，，
(2) 血清蛋白质合成增加(主要是球蛋白的增加)。总蛋白可超过 100g／L，多见于多发性骨髓瘤病人。
血清(浆)总蛋白(TP)测定
血清总蛋白质检测有何临床意义？
4．病理性降低：
(1) 血浆中水分增加，血浆被稀释。因各种原因引起的水钠潴留或输注 过多的低渗溶液。
(2) 营养不良或长期消耗性疾病。如严重结核病和恶性肿瘤等。
临床可报告范围 (clinical reportable range，CRR)， 是允许应用样本稀释、浓缩和预处理后，分析方法可测定样 本中分析物的可靠范围浓度。CRR是扩展的AMR。
方法学评价试验---重复性试验
重复性试验
重复性试验是在相同条件下，用同一方法、同一试 剂和校准品、同一台仪器、在同一实验室由同一人操作 对同一标本在尽可能短的时间内进行多次分析测定（一 般为20次），以获得批内精密度实验数据。其结果反映 各次测定结果间相互接近的程度。其目的在于评价或验 证试验方法的随机误差或不精密度。 包括批内重复性试 验、日内重复性试验和日间重复性试验等。
但由于肝功能有很大代偿能力及清蛋白半衰期较长，因此肝脏病变往 往达到一定程度和一定病程后才能出现血清总蛋白和清蛋白量的改变。
血清(浆)总蛋白(TP)测定
血清总蛋白质检测有何临床意义？
1．生理性升高：剧烈运动后。
2．生理性降低：妊娠。
参考区间：65~85g/L
3．病理性升高（相对少见）：
(1) 血清中水分减少，使总蛋白浓度相对增高。常见于急性失水引 起血液浓缩(如呕吐、腹泻等)；休克时，毛细血管通透性发生变化， 血浆浓缩；慢性肾上腺皮质机能减退的病人，由于钠的丢失继发水分 丢失，血浆也发生浓缩。
干费扰时少，，操费作时要太严长格）计时）
血清(浆)总蛋白(TP)测定
蛋白质检测方法
物理法
电泳法 紫外分光光度法
主此要法有操醋作酸简纤便维、素快薄速膜（电5~泳10、分聚钟丙）烯， 酰不胺消凝耗胶样电品泳，，测等定电后聚仍焦能电回泳收、使双用向， 电灵泳敏等高。，全适自用动于电50泳~1仪00在μg临测床定的。应但用 也受逐蛋渐白增质多中，酪条氨带酸清和晰色，氨分酸辨含效量果的好， 能影看响到，蛋干白扰质因全素貌也，较但多耗（时各较种长嘌，呤需 要和特嘧殊啶仪，器各。种核苷酸，可校正）。 故适用于测定与标准蛋白质氨基酸 组成相似的蛋白质，不适合血清等 组成复杂的蛋白质测定，特别适用 于柱层析洗脱液的快速连续检测。
方法学评价试验---重复性试验
方法学评价常用技术性能指标
分析测量范围(analysis measure range，AMR)是 指对没有进行任何预处理（稀释、浓缩等）的标本，分析方 法能够直接测定出的待测物的范围，也就是系统最终的输出 值（活性或浓度）与被分析物的活性或浓度成线性比例的范 围，即线性范围。
4. 计算CV。
CV
s x
100%
方法学评价试验---重复性试验
结果及讨论
5. 如试验求得的血清TP双缩脲试剂法的CV值＜WHO对中等 实验室提出的OCV(±3%)标准，即表明实验条件的控制达到 最佳条件，试验结果可按OCV%报告。作为方法探讨实验， 其变异系数应该＜OCV标准。
方法学评价试验---重复性试验
方法学评价试验---重复性试验
结果及讨论
（二）变异指数得分（VIS）
WHO对发展中国家在国际质量评价中的标准为VIS＜50为 优秀；VIS＜100为良好；VIS＜150为及格。我国根据具 体情况确定对参加全国质量评价活动的实验室VIS＜80为 优良；VIS＜150为及格。一般认为，VIS＞200，表明结 果中有临床上不允许的误差，而VIS＝400的测定结果则 会造成临床的严重失误，是绝对不许可的。
血清(浆)总蛋白(TP)测定
蛋白质检测方法
染料结合法
常用染料有氨基黑、丽春红、考马斯亮蓝、邻苯三酚红钼等。
氨基黑、丽春红常作为血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳或琼脂 糖凝胶电泳的染料。
考马斯亮蓝(Bradford)1976年由Bradford建立，该法灵敏度 最高（1~5μg），试剂配制简单，检测速度快（5~15分钟）、 简便，，干扰因素少(强碱性缓冲液；TritonX100；SDS)，颜色 深浅随不同蛋白质变化。适用于要求灵敏度高的微量蛋白质快 速定量测定，如尿液、脑脊液等。但有染料粘附比色杯上不易 洗脱的缺点。
结果及讨论
6.变异指数得分（VIS）
V （X X ) 100/T
VI＝V×100／CCV
V为变异百分数，X为各室测 定结果，X为各实验室结果均 值（剔除X+3S以外的结果）, T为靶值,VI为变异指数，CCV 为选定的变异系数。
VIS即变异指数得分。VI＜400时，VIS＝VI；当VI＞40时， VIS＝400,测定结果与靶值完全一样时，VIS＝0
(3) 合成障碍。主要是肝脏功能严重损害时，蛋白质的合成减少，以白 蛋白的下降最为显著。
(4) 蛋白质丢失。大出血时大量血液丢失；肾病时尿液中长期丢失蛋白 质；严重烧伤时，大量血浆渗出等。
血清(浆)总蛋白(TP)测定
蛋白质检测方法
测定原理（特有的结构和性质）
重复的肽链结构 酪氨酸和色氨酸残基对酚试剂反应或紫外吸收 与某些染料特异结合的能力 采用沉淀反应借助浊度或光折射原理测定 电泳的迁移率大小
方法学评价试验---重复性试验
方法学评价常用技术性能指标
灵敏度(sensitivity)是指检测系统可检测出的 最低分析物浓度，或称检测限。
特异度 (specificity，SPE)，又称真阴性率 (true negative rate，TNR)，即实际无病按该 诊断标准被正确地判为无病的百分比。它反映筛 检试验确定非病人的能力。