植物非组培遗传转化方法研究的进展

文献综述

REV IEW

植物非组培遗传转化方法研究的进展

张庆祝　韩天富3

中国农业科学院作物科学研究所,北京,100081

3通讯作者,hantf@mail1caas1net1cn

摘要

在许多植物中,转化效率低一直是制约分子育种和基因功能研究的障碍。目前,在拟南芥等模式植物的研究中,非组培方法已成为遗传转化的主要手段,这些方法在其它植物中也有广阔的应用前景。本文介绍了几种较为成功的非组培遗传转化方法的应用情况和技术原理,并对下一步研究工作提出了建议。

关键词

植物,非组培转化,靶组织/细胞,农杆菌

Non2Tissue Culture Transformation of Plants

Zhang Qingzhu　Han Tianfu3

Institute of Crop Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing,100081

3Corresponding author,hantf@mail1caas1net1cn

ABSTRACT

In many plants,the efficiency of molecular breeding and gene functional analysis are limited because of low transformation rate.At present,non2tissue culture transformation has become the major method of transforma2 tion in model plants like A rabi dopsis.The application of non2tissue culture transformation in other plants is al2 so promising.In this review,the techniques and possible mechanism of several successful non2tissue culture transformation methods are introduced and some advices on the future studies are put forward.

KEYWORDS

Plant,Non2tissue culture transformation,Target tissue/cell,A grobacteri um

植物遗传转化始于20世纪70年代(Hooy2 kaas and Schilperoort,1992),30年来,植物基因工程取得长足发展,转基因作物在生产上大面积推广应用。但是,在大多数植物中还存在转化率低和转基因植株再生、鉴定难,操作周期长等问题(Birch,1997),在基因组研究中获得大量转基因植株仍较困难(Bent,2000)。

目前,植物遗传转化最常用的两种方法是农杆菌介导法和基因枪法,转化的受体组织可以是愈伤组织、原生质体等分离细胞,也可以是完整的植物细胞。这些转化方法有以下不足:(1)依赖于组织培养,操作复杂,操作者需要有较好的专业知识基础和经验;(2)过多的处理常引起受体组织的突变,影响转化的目的性和真实性;(3)

分子植物育种,2004年,第2卷,第1期,第85—91页Molecular Plant Breeding,2004,Vol12,No11,85—91　

转化植株中常出现基因沉默,从而大大降低目的基因的表达效率

许多研究者曾寻找避免组织培养或植株再生的植物基因转化手段,并在实践中摸索出了一些行之有效的方法,这些方法的受体多是分生组织或生殖器官(Birch ,1997)。有的方法也包括一些较为简单的组培,如一些实验室在进行小麦、水稻和谷子等作物的转化时,所用的受体组织是幼嫩的顶端分生组织,其方法是将分生组织去掉或部分划伤,涂抹菌液或DNA ,转化后的组织利用抗生素筛选,再生植株,收获种子;有的方法则不需要任何组培,而直接将农杆菌菌液或钨粉包裹的DNA 溶液涂于顶端分生组织或花器,待植株成熟收获种子后,通过抗生素筛选和分子检测获得转化植株。本文重点介绍几种较为成功的非组培植物基因转化方法,并对转化机制进行简单的总结。

1几种非组培遗传转化方法

111农杆菌介导的浸蘸/喷洒法和真空渗

入法

该方法的发展经历了三个阶段:1)最初在拟南芥中直接将种子与农杆菌共培养,待植株成熟后收获种子,而后进行抗生素筛选、鉴定(Feld 2man and Marks ,1987)。在大豆中,用注射器将农杆菌直接注入种子的胚轴、子叶及子叶与胚轴的连接处,也获得了转化植株(Chee et al 1,1989)。这种方法的缺点是转化效率低(<015%),可靠性和可重复性差。2)“剪涂”法,这种方法主要适用于拟南芥。主要步骤为:剪掉主花序,将农杆菌菌液涂于花中央,几天后剪掉次生花序再涂菌液,如此反复多次,待长成植株收获种子后筛选、检测转化株(Chang et al 1,1994;Katavic et al 1,1994)。这种方法较前一种方法可靠,但操作繁琐。3)真空渗透法。Bechtold 等(1993),首先在拟南芥的转化中获得成功。该方法主要步骤为:在开花早期将花浸入含农杆菌菌液的液体培养基,然后用真空泵抽真空处理再恢复常压,使农杆菌菌液深入到植物组织内部。真空处理之后植株处于一种极度衰弱的状态,需平放于高湿环境中进行恢复性生长,然后转栽于正常生长条件,收获种子筛选、检测转基因植株。真空渗透法操作简便,转化效率较高(>1%)。

此法在拟南芥和其他一些植物中获得成功。例如,Liu 等(1998)该方法在北方小油菜(B rassica cam pest ris L 1ssp 1chi nensis )中获得转化植株;Trieu 等(2000)在豆科植物百脉根(Medicago t runcat ula )上获得成功。与拟南芥不同的是,在百脉根转化中不但可对花进行真空渗透,还可对幼苗进行真空渗透,转化效率相当高(219%～76%),但大部分是多拷贝转化。对幼苗转化获得成功的事实说明,百脉根被转化时植株的发育阶段早于拟南芥。Ronde 等(2001)将大豆种子萌发,与农杆菌共培养一段时间后,抽真空,再将种子种于温室,长成植株后收获种子检测转基因后代,也获得转化植株。在上述实验中,植物发育阶段、抽真空的强度和时间、农杆菌的浓度都对转化效率有影响。

在真空渗透法的基础之上又在拟南芥中发展了浸蘸法(floral dip )和喷洒法(spray )。这两种方法只需将农杆菌菌液与植株的花接触而不需要进行真空处理。所不同的是,在菌液中加入一种表面活性剂物质Silwet L -77(OSi Specialties ,Inc 1,Danbury ,CT ,USA )。Clough 和Bent (1998)首先在拟南芥中用浸蘸法转化获得成功。他们把真空渗透法与浸蘸法作了对比,发现在菌液中加入Silwet L -77后,抽真空对于转化效率影响不大;浸蘸转化过程中加入Silwet L -77与未加入Silwet L -77的处理相比,转化效率差别很大(Clough and Bent ,1998)。研究还发现,用浸蘸法转化拟南芥时,农杆菌液体培养基中除加入Silwet L -77外只需再加入蔗糖即可达到较好的转化效果。另外,转化操作时拟南芥的发育阶段对转化效率影响也很大,一般以开花前5～10天为宜。农杆菌菌液浓度对转化效率影响不大。Curtis 和Hong (2001)采用浸蘸法对萝卜(Raphanus sativ us L 1longi pi nnat us Bailey )转化也获得了成功。他们在比较了植物发育的不同时期对转化效率的影响后发现,主花序的转化效率最高。在Pluronic F -68、Tween 20及Silwet L -77等3种表面活性物质中,Silwet L -77的效果最好。浸蘸法转化大大简化了拟南芥的转化程序,对其它物种的遗传转化也有很好的借鉴价值。

112花粉管通道法

花粉管通道法是利用授粉后形成的花粉管通道,使DNA 得以通过珠心并进入胚囊,整合到未

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分子植物育种

Molecular Plant Breeding